Nitrofen誘導的CDH大鼠中microRNA表達譜及miR-33表達的意義.pdf

1、目的
　　1.探討nitrofen誘導的先天性膈疝（congenital diaphragmatic hernia，CDH）大鼠模型與正常大鼠胎肺中微小RNA（microRNA)表達譜的差異；
　　2.尋找與nitrofen誘導的CDH大鼠肺發(fā)育不良相關的miRNAs并用生物信息學軟件預測其靶基因。
　　方法
　　1.建立nitrofen誘導的CDH大鼠動物模型和實驗分組
　　取SPF（無特定病原體）級成年

2、SD雌性大鼠12只，將其一一編號，并用隨機數(shù)字表分為對照組和nitrofen誘導組，另取6只雄性SD大鼠，將雌性與雄性大鼠按2比1合籠過夜，于第二日上午在顯微鏡下觀察雌性大鼠陰道涂片，有大量精子者視為妊娠，當天上午則定為妊娠第0.5天。nitrofen誘導組大鼠于妊娠第9.5天，經(jīng)胃管注入1 ml nitrofen橄欖油溶液（即將nitrofen溶于橄欖油中，濃度100 mg/ml），對照組大鼠注入1 ml未經(jīng)處理的橄欖油。兩組分別于妊

3、娠第21.5天在麻醉狀態(tài)下行剖宮產(chǎn)取出胎鼠，解剖胎鼠胸腔后取左肺進行下一步實驗。
　　2.取部分胎肺標本進行HE染色處理，觀察對照組和nitrofen誘導組胎肺的發(fā)育情況。
　　3.利用miRNA芯片檢測nitrofen誘導組及對照組大鼠胎肺miRNAs表達，并對其表達譜進行統(tǒng)計學分析；
　　4.挑選miRNA芯片結果中nitrofen誘導組顯著下調的miR-33作為驗證對象，采用實時熒光定量PCR進行驗證；
　

4、　用TriZol法提取大鼠胎肺總RNA，并檢測總RNA濃度，用1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA的完整性；采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測各標本中miR-33和內參U6的表達量，然后分別經(jīng)過校正后得出各個胎肺標本中 miR-33的相對表達量。
　　5.運用生物信息學軟件MiRDB、TargetScan、MICRORNA.ORG預測miR-33可能調控的靶基因。
　　結果
　　1.建立nitrofen誘導的CDH

5、大鼠模型
　　將孕21.5天孕鼠全身麻醉后剖開子宮取出胎鼠，對照組的6只孕鼠得到胎鼠50只；nitrofen誘導組得到胎鼠51只，總的膈疝數(shù)32只，其中左側膈疝25只，占49%，并觀察到誘導組胎鼠膈疝中主要為左側膈疝，還包括少量右側和雙側膈疝，疝入的器官主要為肝臟和胃，少部分為小腸和脾臟。解剖膈疝胎鼠胸腔后可見雙側肺體積均縮小，與對照組相比左側減小程度更大。
　　2.組織學檢查
　　對照組胎鼠左側胎肺發(fā)育較成熟，與其相

6、比，nitrofen誘導組胎鼠左側肺發(fā)育明顯滯后，支氣管分支明顯減少，大部分肺泡塌陷，肺泡管、肺泡囊呈假腺樣體改變，肺泡間隔彌漫性增寬，小動脈肌層增厚，平滑肌增生。
　　3.miRNA表達譜差異分析
　　通過對CDH組和對照組大鼠胎肺中miRNA表達譜的差異分析，CDH組中有11個miRNA上調，分別是miR-3588、miR-382*、miR-363、miR-375、miR-487b、miR-483、miR-382、miR

7、-495、miR-434、miR-181a、miR-99a，有14個下調如 miR-33、miR-193、miR-338、miR-30c-2*、miR-22、miR-18a、miR-532-5p、miR-28、miR-96、miR-551b、miR-141、miR-362*、miR-30a*、miR-3559-5p。
　　4.qRT-PCR檢測結果
　　用qRT-PCR檢測miR-33在nitrofen誘導的先天性膈疝大鼠胎

8、肺中的表達，nitrofen誘導組中miR-33的表達量約為正常組的0.64倍(P<0.05)，與芯片結果一致。
　　5.靶基因預測
　　運用生物信息學軟件對miR-33進行靶基因預測，結果篩選出10個可能的靶基因，包括ABC1、ST18、PDGFRA、PRKAA1、B3GALT2、KRAS、C17orf39、NAA15、HIPK1、HMGA2。
　　結論：
　　miR-33在Nitrofen誘導的CDH組中表達