鼻咽癌細胞microRNA表達譜鑒定及miR-223功能研究.pdf

1、目的:
　　鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是中國南方及東南亞地區(qū)最常見的惡性腫瘤之一。流行病學調(diào)查和病因?qū)W研究顯示，鼻咽癌的發(fā)病具有明顯的民族、地域和家族聚集現(xiàn)象，提示該惡性腫瘤可能是一種在某些特定環(huán)境的影響下涉及多個基因改變的遺傳性疾病。然而，迄今為止，鼻咽癌具體的分子發(fā)病機制尚未完全闡明。
　　微小RNA(MicroRNA，miRNA)是一種在進化過程中高度保守的、內(nèi)源性非編碼小RNA

2、，主要通過與靶mRNA的3端非翻譯區(qū)(3'-untranslated regions，3'-UTRs)結(jié)合后誘導靶mRNA降解或阻遏翻譯，從而達到轉(zhuǎn)錄后抑制特定基因的表達，在諸如細胞增殖、分化和凋亡等多種生物過程中起著基因表達調(diào)控的作用。新近的研究表明，miRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著類似癌基因或抑癌基因的作用。
　　本研究擬采用miRNA芯片篩選鼻咽癌細胞與正常鼻咽上皮細胞中表達差異的miRNA，并探討差異表達的miRNA對鼻

3、咽癌細胞生物學特性的影響，為進一步探索鼻咽癌發(fā)病的分子機制及尋找新的基因治療靶點提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.利用miRNA芯片技術(shù)分析鼻咽癌細胞CNE1、CNE2和永生化鼻咽上皮細胞NP69中的miRNA表達情況，對鼻咽癌中差異表達的miRNA進行篩查，建立鼻咽癌細胞miRNA的基因表達譜。
　　2.結(jié)合real time RT-PCR技術(shù)從中選取表達差異最明顯并可能與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關的miR-223作為我們研

4、究的靶點，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)研究miR-223高表達對鼻咽癌細胞CNE2生物學特性的影響，內(nèi)容包括:
　　(1) CCK-8法檢測miR-223高表達對CNE2細胞增殖能力的影響;
　　(2) Caspase-3法、AnnexinV-FITC/PI檢測法和Hoechst33258染色法檢測miR-223高表達對CNE2細胞凋亡誘導的作用;
　　(3)細胞創(chuàng)傷愈合法和Transwell小室法觀察miR-223高表達對CN

5、E2細胞遷移、侵襲能力的影響;
　　(4)平板克隆形成實驗及軟瓊脂克隆形成實驗觀察miR-223高表達對CNE2細胞克隆形成能力影響。
　　結(jié)果:
　　1.miRNA芯片結(jié)果顯示，在鼻咽癌細胞CNE1中，共檢測到290個人類miRNAs分子，與永生化鼻咽上皮細胞NP69相比較，表達差異達2倍以上的miRNA分子共有116個，其中91個上調(diào)，上調(diào)最顯著的為miR-150（524.97倍），25個下調(diào)，下調(diào)最顯著的為miR

6、-223（0.0001倍）;在鼻咽癌細胞CNE2中，共檢測到300個人類miRNAs分子，與永生化鼻咽上皮細胞NP69相比較，表達差異達2倍以上的miRNA分子共有113個，其中89個上調(diào)，上調(diào)最顯著的為miR-150（341.91倍），24個下調(diào)，下調(diào)最顯著的為miR-223（0.0002倍）。
　　2.Real time RT-PCR檢測miR-223在CNE1、CNE2和NP69中的表達顯示，miR-223在NP69中表達最

7、高，其次是CNE2，再次為CNE1，結(jié)果與芯片結(jié)果基本吻合。
　　3.通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，轉(zhuǎn)染miR-223 mimic入CNE2細胞24 h后，miR-223表達增高2474.64倍。
　　4.通過上調(diào)CNE-2細胞的miR-223水平發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌細胞CNE-2的生長增殖活性減低，凋亡增加，侵襲及遷移能力減弱，克隆形成能力下降。
　　結(jié)論:
　　鼻咽癌細胞中存在大量異常表達的miRNA分子，這些分子可能通過調(diào)節(jié)