shRNA表達載體抗豬傳染性胃腸炎病毒感染的研究.pdf

1、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)屬冠狀病毒科冠狀病毒屬成員，可導致豬傳染性胃腸炎(TGE)。該病是豬的一種急性、高度傳染性胃腸道疾病，常在冬春季節(jié)呈暴發(fā)性流行，病豬以嘔吐、水樣腹瀉、嚴重脫水為臨床特征。不同年齡和品種的豬對本病均易感，其中兩周齡以內(nèi)的仔豬死亡率可達100％，死亡原因通常為脫水和電解質(zhì)紊亂。隨著年齡的增大，死亡率會逐漸下降，但是耐過豬生長發(fā)育遲緩，飼料報酬率降低。本病發(fā)病迅速，危害嚴重，波及范圍廣，呈世界范圍分布，大多數(shù)養(yǎng)豬

2、國家都有本病發(fā)生，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。我國自從50年代首次報道TGE以來，部分地區(qū)仍有該病發(fā)生和流行，甚至在局部地區(qū)暴發(fā)。針對TGE，常規(guī)藥物沒有明顯治療效果，目前常用的治療措施是疫苗接種。但是廣泛使用的常規(guī)疫苗本身存在著各種各樣的缺陷：滅活苗制作成本高而保護能力低；弱毒苗存在散毒和返強的危險，而且干擾田間野毒感染的診斷；而作為替代的基因工程疫苗、核酸疫苗等因生產(chǎn)成本及免疫保護能力等問題大多尚處于實驗室階段，還有較長的一段路

3、要走。所有這些均成為有效防治TGE、發(fā)展養(yǎng)豬業(yè)的瓶頸。繼續(xù)研制新型、安全和更有效的TGEV疫苗或其他防治措施為必然之勢。RNAi是生物體自身固有的抵御外來感染的機制。它通過嚴格的基因序列互補特異降解靶mRNA。憑借高效特異、經(jīng)濟便捷的優(yōu)勢，RNAi技術已經(jīng)遠遠超過了傳統(tǒng)的反義基因調(diào)控技術，一躍成為哺乳動物體外和體內(nèi)科學研究的強大工具，在抗癌癥、抗病毒感染方面顯示出巨大發(fā)展?jié)摿?。許多疑難疾病和大量已知序列的動植物病毒已經(jīng)在基因水平被很好抑

4、制。本病病原TGEV，病原學分類明確，一般生物學特性以及基因組結構、功能等研究較為透徹，并且是單股正鏈RNA病毒，本身即可行使mRNA功能。所以，運用RNAi技術抗TGEV感染有著很好的技術背景和生物學基礎。本研究考慮運用特異高效、技術日趨成熟而成本日益下降的RNAi技術來預防TGEV感染，試圖為突破TGE防治瓶頸、拓展TGEV防治手段作一有益探索；并希望通過小型豬體內(nèi)RNAi抗TGEV的試驗研究，為臨床研制抗病毒制劑做準備，并為大型動

5、物體內(nèi)RNAi及相關腸道病毒性疾病的RNAi提供參考資料。共分以下三個部分： 第一部分：首先，通過對TGEs-1基因易突變區(qū)(S基因5’端)設計跨突變區(qū)引物，成功擴增了國內(nèi)分離株TGEs-1的S基因5’端序列，包括小部分聚合酶基因序列。把測序結果與GenBank中TGEVSC-Y分離株同源序列比對，結果顯示同源性為98％。接著，把TGEs-1S基因5’端所測序列與國內(nèi)己發(fā)表的TGEVSC-Y基因組其他部分較為保守的序列相結合，利

6、用相關設計軟件設計了靶向病毒復制相關基因區(qū)的7條siRNA，并成功構建了8個帶EGFP基因的shRNA表達載體：pEGFP-U6/P1、pEGFP-U6/P2、pEGFP-U6/S1、pEGFP-U6/S2、pEGFP-U6/M、pEGFP-U6/N1、pEGFP-U6/N2以及非特異性干擾對照載體(pEGFP-U6/T)。以上結果均為在后續(xù)細胞水平和小型豬體內(nèi)有效而穩(wěn)定地干擾TGEs-1的復制打下了基礎。 第二部分：在細胞水平

7、研究了shRNA表達載體抗TGEV感染的作用：ST細胞培養(yǎng)到70-80％融合時，對細胞分別轉(zhuǎn)染不同的shRNA表達質(zhì)粒(0.4μg∥孔)。轉(zhuǎn)染28h后，分別對細胞感染TGEs-1(200CCID50)，并于感染后40小時對培養(yǎng)物進行分析。CPE分析發(fā)現(xiàn)，pEGFP-U6/P2和pEGFP-U6/P1轉(zhuǎn)染孔未出現(xiàn)細胞病變或只在培養(yǎng)孔邊緣呈現(xiàn)微弱的疑似“病變”(pEGFP-U6/P1，TGEV病變一般從孔邊緣開始向孔中部漫延)，而其他各干擾

8、孔均出現(xiàn)了TGEV特征性病變，只是病變程度不同。相比之下，shRNA表達載體pEGFP-U6/S1和pEGFP-U6/N1抗病變的能力較強，只在孔的邊緣出現(xiàn)不同程度的病變，而pEGFP-U6/S2、pEGFP-U6/M以及pEGFP-U6/N2孔細胞的病變程度重，幾乎整孔細胞出現(xiàn)病變。其中，pEGFP-U6/S2和pEGFP-U6/N2干擾孔的病變與非特異干擾孔pEGFP-U6/T的情況接近。結果表明，shRNA表達載體pEGFP-U6

9、/P1、pEGFP-U6/P2、pEGFP-U6/S1和pEGFP-U6/N1對細胞的保護能力較強。尤其是，shRNA表達載體pEGFP-U6/P1和pEGFP-U6/P2，CPE和MTS的分析結果都表明，兩者可以在細胞水平高效保護ST細胞抵御TGEs-1引起的病變。而且RT-qPCR分析結果也顯示，這兩個質(zhì)粒與非特異質(zhì)粒pEGFP-U6/T相比，可顯著減少細胞培養(yǎng)物中的病毒RNA含量，其中，pEGFP-U6/P2幾乎達到100％抑制，

10、由此證明上述的抗細胞病變效應是源自序列特異的RNAi作用。綜合以上結果，我們初步篩選出pEGFP-U6/P1和pEGFP-U6/P2作為進一步實施小型豬體內(nèi)試驗研究的shRNA表達載體。 第三部分：研究了在小型豬體內(nèi)shRNA表達載體抗TGEV感染的作用。對12頭25日齡的小型豬分組，分別設3個干擾組(pEGFP-U6/P1、pEGFP-U6/P2、兩種載體協(xié)同干擾組)和3個對照組(非特異干擾pEGFP-U6/T、只攻毒、正常)

11、，每組2頭仔豬。然后分別從前腔靜脈注射shRNA表達載體(3mg/20ml/豬)，并于24h后攻毒(10ml/豬)。3天后處死，采集肝、肺、腎、空腸、回腸、盲腸、脾和腸系膜淋巴結。每個樣品分三份，分別用于制作石蠟切片、冰凍切片和RT-PCR檢測。在攻毒26小時后，只攻毒豬就開始拉黃色稀便，站立不穩(wěn)，脫水、消瘦。這種情況一直持續(xù)到采樣，而其他豬表觀正常，食欲旺盛。病理切片分析結果顯示，部分pEGFP-U6/P1、pEGFP-U6/P2干擾