豬傳染性胃腸炎病毒LJ-12株的分離及鑒定.pdf

1、豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV）作為一種病原引起豬傳染性胃腸炎(Transmissible gastroenteritis，TGE)。該病在臨床診斷方面的主要病理特征表現(xiàn)為嘔吐、水樣腹瀉和嚴重脫水，屬于豬的一種高度接觸性和急性傳染病。本病對各年齡段的豬都易感，可引起兩周齡以下的仔豬死亡，致死率高達100％。該病流行范圍廣，發(fā)病和致死率極高，是我國及世

2、界其他國家仔豬死亡的重要疫病，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。對TGE的防制主要以疫苗免疫預(yù)防為主。由于TGEV分離培養(yǎng)相對困難，初代分離的病毒難以適應(yīng)細胞，病毒繁殖滴度低及產(chǎn)量低，是目前對該病毒研究所面臨的主要問題，因此流行毒株的分離培養(yǎng)并獲得穩(wěn)定適應(yīng)細胞的TGEV地方毒株，是研制TGE疫苗的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　 本實驗對黑龍江省某豬場腹瀉仔豬的糞便通過核酸提取及RT-PCR鑒定，用TGEV的S基因引物擴增到一段約480bp的基

3、因序列，同時用PRV及PEDV的引物進行RT-PCR沒有擴增到目的基因，將擴增到的目的基因測序，結(jié)果表明該基因序列與TGEV TH-98株的S基因核苷酸序列同源性為98.5％，表明發(fā)病豬場腹瀉仔豬的糞便中含有TGE病毒。將該糞便病料經(jīng)離心、過濾后進行病毒分離，在原代豬腎和豬睪丸細胞上分別盲傳8代后細胞出現(xiàn)病變;通過超薄切片電鏡觀察，普通電鏡觀察，免疫電鏡觀察確定了該病毒的形態(tài)是有囊膜的冠狀病毒，直徑大小在80～100 nm，將該病毒分離

4、株命名為TGEV LJ-12株。間接免疫熒光實驗，間接ELISA實驗可見盲傳9代后的細胞培養(yǎng)毒均出現(xiàn)了特異性的陽性反應(yīng)。通過提取病變細胞培養(yǎng)液中的病毒RNA，使用套式PCR方法擴增出TGE病毒S基因的一段長約384bp的序列，將序列與GenBank上發(fā)表的多株流行毒株進行比較，可見TGEV LJ-12株該段基因的核苷酸序列同源性均達到94％以上。
　　 根據(jù)GenBank上發(fā)表的豬傳染性胃腸炎病毒基因序列，使用套式PCR方法，設(shè)

5、計了針對N基因的特異性外套引物P1/P2，內(nèi)套引物N1/N2和N3/N4，P1/P2擴增長度為1167 bp，N1/N2和N3/N4分別為475 bp和476bp。對原代豬腎細胞繁殖的TGEV LJ-12株病毒進行RT-nested-PCR檢測，通過DNAStar軟件與多株序列比較，結(jié)果顯示擴增得到的TGEV LJ-12株N基因的兩段序列同源性均達到94％以上，經(jīng)原代豬腎細胞繁殖至20代仍可以檢測到，表明該病毒已經(jīng)分離成功并已適應(yīng)在原代

6、細胞上繁殖。
　　 應(yīng)用經(jīng)原代豬腎細胞繁殖至15代的細胞培養(yǎng)毒進行動物實驗，對剛出生未哺乳的SPF巴馬香豬灌服20 mL細胞培養(yǎng)毒，實驗豬在第8天死亡，對其糞便和小腸進行RT-nested-PCR方法檢測，可見攻毒仔豬從第三天開始排毒，糞便中可檢測到特異性的RT-PCR反應(yīng)帶，均在內(nèi)套PCR出現(xiàn)與預(yù)期結(jié)果相符合的約475 bp的N基因目的條帶。測序結(jié)果表明，與灌服之前的細胞培養(yǎng)毒的基因序列比較，序列未發(fā)生變化;通過免疫熒光檢測方