豬傳染性胃腸炎病毒S1基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化番茄的研究.pdf

1、豬傳染性胃腸炎(Transmissible gastroenteritis of swine，TGE)是由豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis coronavirus，TGEV)引起的一種以嚴(yán)重腹瀉、嘔吐和脫水為臨床特征的高度接觸性傳染病，不同年齡和品種的豬對(duì)其均易感，其中1～2周齡以下的仔豬致死率可達(dá)到100％，給養(yǎng)豬業(yè)造成極大的危害。預(yù)防該病的有效措施是疫苗接種，傳統(tǒng)的常規(guī)疫苗的研制都是以大

2、量培養(yǎng)病原微生物為基礎(chǔ)，這不僅給疫苗的制造帶來局限性，同時(shí)也存在潛在的不安全因素，如病原微生物滅活不徹底，導(dǎo)致強(qiáng)毒散播；弱毒疫苗存在毒力返強(qiáng)等問題。而利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)可食（飼）疫苗，具有成本低廉，安全性好，生產(chǎn)速度快，接種簡單以及易于運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)，正在引起越來越多的科學(xué)家的關(guān)注。在TGEV結(jié)構(gòu)蛋白中，S蛋白是唯一能在動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的主要結(jié)構(gòu)蛋白。因此，S蛋白基因是研究TGEV基因工程疫苗的主要目的基因。本研究的目的是利用RT-

3、PCR技術(shù)把S基因5’端包含A、D兩個(gè)抗原位點(diǎn)的一段序列(S1)克隆入植物表達(dá)載體系統(tǒng)中，構(gòu)建重組植物表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化番茄，使S1蛋白在番茄中獲得表達(dá)，為研究TGEV可食性疫苗莫定基礎(chǔ)。
　　 本研究根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中的TGEV全基因序列(NC002306)設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，針對(duì)S基因5’端A、D兩個(gè)抗原位點(diǎn)的序列(S1)，并含有XbaI和SmaI酶切位點(diǎn)。用RT-PCR技術(shù)從國內(nèi)分離的TGEV HN-200

4、2株中獲得的PCR產(chǎn)物，經(jīng)純化后將其連接到pMD18-T載體上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5a，然后在氨芐抗性（Amp+)平板上挑取陽性菌落，37℃過夜培養(yǎng)。提取質(zhì)粒經(jīng)PCR，XbaI和SmaI雙酶切鑒定，結(jié)果擴(kuò)增片段與預(yù)期片段大小相符；DNA序列分析結(jié)果表明，擴(kuò)增的S1基因大小為912bp，完全符合載體閱讀框，與TGEV HN-2002株核苷酸序列和氨基酸序列符合率均為98％。將鑒定為陽性的pMD18-T/S1質(zhì)粒與植物表達(dá)載體同

5、時(shí)進(jìn)行XbaI和SmaI酶切，分別經(jīng)回收后連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5a，然后在卡那霉素抗性（Kan+)平板上挑取陽性菌落，37℃過夜培養(yǎng).提取質(zhì)粒經(jīng)PCR，XbaI和SmaI雙酶切鑒定，擴(kuò)增和酶切出的基因片段與S1基因片段大小相同(912bp)，結(jié)果表明目的基因S1成功連接到植物表達(dá)載體35SCaMV+NOS上，與預(yù)計(jì)相符，將陽性重組質(zhì)粒命名為35SCaMV+NOS/S1.TGEVS1基因植物表達(dá)載體構(gòu)建成功.
　　

6、 將陽性重組質(zhì)粒35SCaMV+NOS/S1經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化進(jìn)入農(nóng)桿菌AGL1中，在卡那霉素和利福平抗性(Kan++Rif+)平板上挑取陽性菌落，28℃在5ml相同抗性的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)36～48h，取出100ul菌液于50ml相同抗性的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h至OD600=0.5～1.0。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將上述重懸菌液轉(zhuǎn)染番茄子葉5min，轉(zhuǎn)基因番茄受體經(jīng)過共培養(yǎng)、脫菌培養(yǎng)、篩選培養(yǎng)、壯苗培養(yǎng)和生根培養(yǎng)不斷分化長出綠苗，最終獲得50株抗性植