抗豬傳染性胃腸炎病毒中草藥的篩選及作用機(jī)制初步研究.pdf

1、[目的]豬傳染性胃腸炎（TGE）是由豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）引起的以腹瀉、嘔吐、脫水、2周齡以內(nèi)的仔豬死亡率高為特征的一種高度接觸性急性傳染病，給養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴(yán)重危害。本研究通過細(xì)胞培養(yǎng)初步建立了TGEV體外感染模型，從常見的抗病毒中草藥中篩選藥物進(jìn)行體外抗病毒試驗，篩選出具有抗TGEV作用的中草藥，為臨床用藥提供理論依據(jù)。 [方法] （1）培養(yǎng)PK-15細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞長成單層后，接種TGEV病毒，每天觀察細(xì)胞生長情況

2、。在細(xì)胞上盲傳若干代數(shù)使之產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變（CPE），然后反復(fù)凍融3次，收集病毒液置-70℃保存?zhèn)溆?。根?jù)TGEV的sM基因和ORF7之后的3'-UTR保守區(qū)域設(shè)計合成兩對引物，對TGEV進(jìn)行RT-PCR檢測，并對擴(kuò)增的3'-UTR非編碼序列片段進(jìn)行核酸測序鑒定。將TGEV疫苗免疫小鼠制備血清，通過間接免疫熒光試驗檢測TGEV。 （2）從常見的具有抗病毒功能及臨床上治療TGE的中草藥中篩選抗TGEV藥物。將單藥分別進(jìn)行水提，水

3、提物的終濃度為100mg/mL，高壓滅菌后4℃貯存?zhèn)溆?。中藥提取物用?xì)胞維持液2倍梯度稀釋，將中藥與長滿單層的PK-15細(xì)胞于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)作用72h。最終，通過觀察細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞單層是否完整對提取物的細(xì)胞毒性進(jìn)行評價，確定藥物的最大安全濃度（TC0）。 （3）以藥物的最大安全濃度為起點，將中藥提取物用細(xì)胞維持液2倍梯度稀釋成不同濃度，然后按三種不同方式（即先加中藥后加病毒、先加病毒后加中藥、病毒和中藥同時加入）于長

4、滿單層的PK-15細(xì)胞中加入中藥和病毒，作用72h后，觀察中藥對病毒致細(xì)胞病變的影響，并通過MTT法檢測剩余活細(xì)胞的數(shù)量，再通過T檢驗比較加藥組和病毒對照組的OD值，確定藥物抗病毒最小濃度，計算藥物的抑制指數(shù)和細(xì)胞保護(hù)率，分析中藥體外抗TGEV活性。 [結(jié)果] （1）TGEV在PK-15細(xì)胞上盲傳四代后產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變，表現(xiàn)為細(xì)胞變圓、脫落、拉網(wǎng)等，而對照細(xì)胞形態(tài)仍為不規(guī)則的三角形，細(xì)胞單層完整。通過對細(xì)胞培養(yǎng)物的PC

5、R擴(kuò)增，得到大小為516bp、346bp的兩條預(yù)期條帶。對3'-UTR非編碼序列進(jìn)行核酸序列測序并與TGEV的其他毒株的該同源序列進(jìn)行序列對比，同源性達(dá)97%～99%。間接免疫熒光試驗檢測接毒細(xì)胞可以看到特異性綠色熒光。通過以上試驗證明了有TGEV存在。初步建立起用于篩選抗TGEV中草藥的細(xì)胞模型。 （2）通過形態(tài)學(xué)觀察表明，中草藥提取物一般在高濃度（>25mg/mL）下使PK-15細(xì)胞單層受到破壞，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變；低濃度下細(xì)

6、胞則正常。和正常對照細(xì)胞相比，中藥提取物對細(xì)胞的安全濃度一般在6.25～12.5mg/mL之間，但黃芪的安全濃度較大，當(dāng)濃度高達(dá)50mg/mL時，細(xì)胞形態(tài)仍然正常。 （3）根據(jù)MTT檢測結(jié)果，通過T檢驗分析表明，能抑制病毒吸附的藥物有：黃芪、黃芩，抑制指數(shù)分別為：4、4。能直接殺滅病毒的藥物有：大黃、金錢草、重樓，抑制指數(shù)分別為：8、8、16。但尚未篩選出能抑制病毒復(fù)制的中藥。 [結(jié)論] （1）TGEV在PK-1