2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、水貂阿留申病(Aleutian Disease,AD)是由細(xì)小病毒亞科(Parvovirinae)阿留申水貂病毒屬(Amdovirus)水貂阿留申病毒(Aleutian mink disease virus,ADV)引起的免疫系統(tǒng)病理性失調(diào),是一種主要侵染水貂、病程緩慢的傳染性疾病。該病以垂直和水平傳播兩種形式在世界各國的貂群中廣泛流行,導(dǎo)致沒有抗體的新出生幼貂的急性間質(zhì)性肺炎甚至死亡,成年水貂的繁殖能力、皮張質(zhì)量、健康狀況下降以及死亡

2、率增加,對水貂養(yǎng)殖業(yè)造成不可低估的經(jīng)濟(jì)損失。近年來,我國水貂養(yǎng)殖區(qū)阿留申病的流行情況在國內(nèi)時有報道,高水平的AD感染一直是嚴(yán)重影響我國水貂養(yǎng)殖業(yè)高效、健康發(fā)展的一個非常重要的因素之一。由于目前針對該病缺少有效的防治方法,普遍采用的是通過定期檢測,淘汰患病貂群,從而達(dá)到凈化種群的目的。因此,在國內(nèi)進(jìn)行分離鑒定病毒株及進(jìn)行分子生物學(xué)特性研究,建立國內(nèi)適用的血清學(xué)診斷方法,將會對今后國內(nèi)開展水貂阿留申病的臨床診斷、有效防制及進(jìn)一步的深入研究,

3、提供更多的科學(xué)依據(jù)。 在本研究中,首先通過CIEP以及本實驗室建立的ADV PCR檢測方法,對黑龍江某水貂養(yǎng)殖場發(fā)病送檢貂以及遼寧某水貂養(yǎng)殖區(qū)疑似阿留申病貂進(jìn)行檢測,將經(jīng)兩種方法檢測均為陽性結(jié)果的毒株進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列測定,從中抽取序列較為保守的四株病毒與標(biāo)準(zhǔn)對照毒株進(jìn)行序列比對和同源性分析,與ADV-G相應(yīng)片段的核酸同源率分別為92.8%、93.9%、93.2%和93.5%,與參考株ADV-Utah的同源率分別為94.5

4、%、98%、94.6%和95.5%,確定為ADV特異性核苷酸片段。依據(jù)鑒定的結(jié)果,成功鑒定了四株病毒,分別命名為MS-1、DL-1、DL-2和DL-3。 將MS-1、DL-1、DL-2和DL-3株病毒經(jīng)組織病料提取總DNA,采用依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)毒株ADV-G的DNA序列設(shè)計并合成的四對引物,經(jīng)PCR擴(kuò)增后分別構(gòu)建重組質(zhì)粒并測序,將測序結(jié)果用DNA Star軟件中的SeqMan程序進(jìn)行拼接,獲得四株病毒的近全長DNA序列。用DNA Sta

5、r軟件MegAlign程序中的Jotun Hein method將實驗測得的毒株與國外病毒參考株的對應(yīng)核苷酸序列進(jìn)行同源性比較和進(jìn)化樹分析。結(jié)果表明,ADV-Utah與四個實驗毒株的序列同源性較高,同源率為92.9-93.4%,ADV-G、ADV-SL3與實驗毒株的同源性較低;四個實驗毒株和三個參考毒株被分別劃歸為兩個組,分屬于兩個進(jìn)化分支;實驗毒株中ADV-DL1與DL2和DL3雖然同為大連分離株,卻表現(xiàn)出較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系。用DNA S

6、tar軟件MegAlign程序中的Clustal W method將實驗測得的ADV毒株核苷酸序列、ADV參考株序列以及細(xì)小病毒其它四個屬的代表毒株全序列進(jìn)行進(jìn)化樹分析,發(fā)現(xiàn)14株病毒共劃歸為五個相對獨(dú)立的進(jìn)化分支,ADV與牛犬細(xì)小病毒作為細(xì)小病毒亞科中新增的屬,與其它屬的成員分屬于不同的進(jìn)化分支,分析結(jié)果驗證了ICTV8公布的新分類體系的合理性。 選擇VP2蛋白主要抗原表位區(qū)相對保守的ADV MS-1毒株作為種毒,分別設(shè)計合成

7、兩對引物,用PCR方法擴(kuò)增其VP2基因中主要抗原表位區(qū)的兩個片段,分別將其克隆到原核表達(dá)載體pMAL-c2的多克隆位點(diǎn)中,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pMAL-VP2a和pMAL-VP2b,經(jīng)PCR擴(kuò)增、酶切和測序分析確證其正確插入到表達(dá)載體中,閱讀框正確,成功地構(gòu)建了原核表達(dá)載體。陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌TB1,用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE檢測和免疫印跡分析。結(jié)果表明兩段融合蛋白均以包涵體形式獲得了有效表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物分別占

8、總菌體蛋白的32.7%和37.41%;表達(dá)產(chǎn)物的分子質(zhì)量分別約為63kD和65kD,與理論推測的分子質(zhì)量一致;在終濃度為1mM的IPTG誘導(dǎo)下,4h時其表達(dá)量達(dá)到高峰;Westem blot分析表明表達(dá)蛋白能被兔抗MBP抗體所識別。將分離和初步純化的表達(dá)包涵體蛋白作為抗原,對陽性血清進(jìn)行CIEP檢測,驗證其免疫活性,并與標(biāo)準(zhǔn)抗原的CIEP檢測結(jié)果相比較,二者的符合率達(dá)到94.3%。以本實驗獲得的重組蛋白作為診斷抗原的特異性、重復(fù)性、敏感

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