口服抗生素改變大鼠腸道菌群和大腦海馬腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)及其恢復(fù).pdf

1、背景:腸道正常菌群的數(shù)量巨大，主要定植在腸下游，并與宿主共生，可以幫助宿主抵抗病原菌的入侵、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)吸收及調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的發(fā)育等。最近的研究表明，腸道菌群通過(guò)代謝、神經(jīng)、免疫和內(nèi)分泌等途徑影響CNS(CentralNervous System，中樞神經(jīng)系統(tǒng))的功能。這幾條途徑分別通過(guò)不同的生物活性物質(zhì)來(lái)發(fā)揮作用，在代謝途徑:菌群可將食物中的Trp（Tryptophan，色氨酸）代謝為5-HT（5-hydroxytryptamine，5-羥

2、色胺）或犬尿酸(Kynurenic acid)，或直接產(chǎn)生神經(jīng)遞質(zhì)GABA（γ-aminobutyric，γ氨基丁酸）起作用。在神經(jīng)途徑:菌群通過(guò)連接腸壁和中樞的迷走神經(jīng)發(fā)揮作用。在免疫途徑:通過(guò)菌群作用于腸粘膜免疫細(xì)胞產(chǎn)生各種細(xì)胞因子，分泌至血液。在內(nèi)分泌途徑:菌群通過(guò)影響腸內(nèi)分泌細(xì)胞分泌5-HT等起作用。而大腦也可因?yàn)榫o張和壓力，釋放CORT（Corticosterone，腎上腺酮）、E（Epinephrine，腎上腺素）和NE(N

3、oradrenaline，去甲腎上腺素)等，通過(guò)這些遞質(zhì)影響腸道菌群。各條途徑可能是并行的，同時(shí)在不同水平也存在相互影響。這種雙向交流機(jī)制，使得大腦能夠調(diào)控胃腸道功能并對(duì)微生物入侵做出反應(yīng)，同時(shí)，胃腸道的改變也會(huì)影響CNS和情緒。大腦內(nèi)的海馬與個(gè)體的認(rèn)知功能、記憶構(gòu)建及情緒管理有關(guān)。海馬分泌的BDNF（Brain-Derived Neurotropic Factor，腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子）是一類對(duì)神經(jīng)元的發(fā)育和正常生理功能起重要作用的蛋白

4、，它能支持神經(jīng)元的存活、調(diào)節(jié)細(xì)胞分化和基因表達(dá)，促進(jìn)軸突的生長(zhǎng)和正常生理功能的恢復(fù)。近年來(lái)，將益生菌應(yīng)用于包括自閉癥、抑郁和焦慮等精神疾病的治療中，取得了一定的效果。而腸道菌群是怎樣影響宿主CNS，其具體的機(jī)制尚不十分清楚。因此研究腸道菌群對(duì)CNS的作用具有理論和實(shí)際應(yīng)用的價(jià)值。
　　目的:探討口服抗生素大鼠腸道菌群變化及海馬BDNF的表達(dá)及其能否恢復(fù)。
　　方法:1.雄性SD大鼠，180-220g，40只，隨機(jī)分為四組，每

5、組10只。三周對(duì)照組一直飲用純凈水，抗生素組的飲用水中添加腸道不吸收的抗生素，它是新霉素、桿菌肽和游霉素三種抗生素的混合物（新霉素5mg/mL;桿菌肽5mg/mL;游霉素1.25μg/mL），飲用三周，建立菌群改變模型。六周對(duì)照組一直飲用純凈水，恢復(fù)組飲用三周上述抗生素后，改為純凈水，再飲用三周，建立菌群恢復(fù)的模型。2.DGGE（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，變性梯度凝膠電泳）檢測(cè)腸道菌

6、群多樣性改變;高通量16S rDNA V4區(qū)測(cè)序分析腸道菌群的組成。3.實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)大鼠大腦海馬BDNF及IL-1β(Interleukin-1β，白細(xì)胞介素-1β)的改變。4.HE染色（Haematoxylin and eosin，蘇木精伊紅染色法）及電鏡觀察結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)變化，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)腸IL-1β和IL-10（Interleukin-10，白細(xì)胞介素-10）、Dβh（Dopamine-β-hydroxylase，多

7、巴胺β羥化酶）的表達(dá)。5.動(dòng)物行為學(xué)Step-down實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其焦慮程度。
　　結(jié)果:1.抗生素處理大鼠三周其腸道菌群的多樣性和對(duì)照相比降低（Simpson指數(shù)，抗生素組為0.17±0.023，對(duì)照組為0.043±0.0033，p＜0.05;Shannon指數(shù)，抗生素組為2.7±0.081，對(duì)照組為4.5±0.039，p＜0.05），類桿菌屬（Bactero-ides）、理研菌科(Rikenellaceae)中的未知名屬、毛螺旋菌

8、科的瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、克雷伯菌屬（Klebsiella）等的百分含量升高，而副類桿菌屬（Parabacteroides）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、羅氏菌屬（Roseburia）、顫螺菌屬（Oscillospira）、瘤胃球菌科的瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、考拉桿菌屬（Phascolarctobacterium）、薩特菌屬（Sutterella）、螺桿菌屬（Helicobacter）、厭氧

9、支原體屬（Anaeroplasma）等的百分含量顯著降低;恢復(fù)三周后大鼠的腸道菌群多樣性恢復(fù)（Simpson指數(shù)，恢復(fù)組為0.043±0.019，對(duì)照組為0.037±0.0033，p＞0.05; Shannon指數(shù)，恢復(fù)組為4.5±0.28，對(duì)照組為4.5±0.10，p＞0.05），之前與對(duì)照組明顯不同的類桿菌屬、理研菌科的未知名屬、克雷伯菌屬、乳桿菌屬、羅氏菌屬、顫螺菌屬、考拉菌屬、薩特菌屬等的百分含量均得到恢復(fù)，而寡源桿菌屬（Oli

10、gella）、毛螺旋菌科的羅氏菌屬（Roseburia）等的百分含量未恢復(fù)。
　　2.抗生素處理三周大鼠大腦海馬BDNF mRNA的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，海馬BDNF mRNA的表達(dá)水平與對(duì)照組的相對(duì)含量為1.6∶1.0(對(duì)照組人為的設(shè)為1.0)，(p＜0.05)，恢復(fù)三周時(shí)BDNF與對(duì)照組為1.1∶1.0（對(duì)照組人為的設(shè)為1.0），(p＞0.05)。
　　3.抗生素處理三周，大鼠的結(jié)腸粘膜下層疏松，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較明顯，結(jié)

11、腸內(nèi)促炎因子IL-1β的mRNA表達(dá)明顯升高（抗生素組為2.7±0.072×10-3，對(duì)照組為0.94±0.049×10-3，p＜0.01），而抗炎因子IL-10的mRNA表達(dá)明顯下降（抗生素組為3.4±0.21×10-5，對(duì)照組為5.8±0.26×10-5，p＜0.05）;恢復(fù)三周時(shí)大鼠結(jié)腸粘膜層完整，腸管無(wú)擴(kuò)張，無(wú)明顯的炎性細(xì)胞聚集，與對(duì)照組相比無(wú)病理上的差別，促炎因子IL-1β和抗炎因子IL-10的表達(dá)與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異(p

12、＞0.05)。
　　4.抗生素處理大鼠三周引起結(jié)腸內(nèi)合成NE的酶即Dβh的升高（抗生素組為14.6±1.7×10-6，對(duì)照組為8.8±1.0×10-6，p＜0.05），而這種變化在恢復(fù)三周時(shí)回到正常水平（恢復(fù)組為13.8±0.9×10-6，對(duì)照組為12.3±0.7×10-6，p＞0.05）。
　　5.抗生素處理大鼠三周不引起其大腦海馬內(nèi)促炎因子IL-1β變化，電鏡下未見(jiàn)結(jié)腸微絨毛的明顯改變。
　　6.在三周和六周時(shí)分別