重癥肺炎外周血單核細(xì)胞TLR2、4表達(dá)與血漿TNF-α、IL-1β、IL-8水平的相關(guān)性.pdf

1、背景：
　　 重癥肺炎是以細(xì)菌、病毒為主要的微生物入侵機(jī)體后引發(fā)的炎癥免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)紊亂性疾患，誘導(dǎo)以TNF-α、IL-1β及IL-8等前炎癥細(xì)胞因子過度活化，促發(fā)炎癥反應(yīng)，最終觸發(fā)炎癥細(xì)胞因子的級聯(lián)反應(yīng)而導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)。什么原因?qū)е卵装Y因子的過度表達(dá)？目前還沒有很好的解釋。TLRs的發(fā)現(xiàn)是近年來天然免疫研究的一個重大進(jìn)展，已證明該

2、受體在感染免疫中起重要作用[1]。TLR2、4在TLR家族中占有重要的位置，其發(fā)現(xiàn)被稱為是感染性疾病免疫機(jī)制研究中的重要里程碑。TLRs識別其配體后，激活NF-ΚB等轉(zhuǎn)錄因子和蛋白激酶，釋放炎性介質(zhì)激活天然免疫；同時還使抗原呈遞細(xì)胞表達(dá)協(xié)同刺激分子CD80、CD86，而最終啟動后續(xù)的T細(xì)胞、B細(xì)胞介導(dǎo)的特異性免疫[2]。TLR2、4作為重要的炎性受體，主要分布于髓源性單核細(xì)胞表面，在臨床重癥肺炎患者外周血在單核細(xì)胞上表達(dá)與炎癥細(xì)胞因子表

3、達(dá)情況，尚未見報道，有待進(jìn)一步研究。
　　 目的：
　　 在蛋白水平上及mRNA分子水平研究重癥肺炎外周血單核細(xì)胞的表達(dá)，初步探討TLR2、4表達(dá)在重癥肺炎炎性反應(yīng)的作用，觀察重癥肺炎患者外周血單核細(xì)胞上TLR 2、4表達(dá)及血漿中TNF-α、IL-1β、IL-8水平及PSI評分的相關(guān)性。
　　 資料和方法：
　　 1標(biāo)本來源
　　 2008年8月一2009年05月入住廣州市第一人民醫(yī)院呼吸科的重癥

4、肺炎患者，均符合美國胸科學(xué)會(ATS)于2007年制定的重癥肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)。肺炎組均符合我國社區(qū)獲得性肺炎的診斷依據(jù)，健康對照組來自同期門診健康體檢者。經(jīng)本人及家屬知情同意后抽取外周靜脈血。重癥肺炎患者 12例、肺炎組18例、健康組12例。各抽血11mL，EDTAK3抗凝。
　　 2 方法
　　 2.1單核細(xì)胞表面TLR2、4的表達(dá): 采用全血三色免疫熒光單抗直接標(biāo)記技術(shù)。取1ml EDTAK3抗凝血，每份標(biāo)本分裝2管，設(shè)

5、測定管及同型對照管。用FITC、PE、APC熒光素直接標(biāo)記單克隆抗體，檢測單核細(xì)胞上的三個表位(TLR2、TLR4、CD14)。用BD FACSDivaTM軟件進(jìn)行獲取與分析，使用前向散射角(FSC)及側(cè)向散射角(SSC)確定單核細(xì)胞群，再以FSC/CD14一APC雙參數(shù)設(shè)門，每管分析門內(nèi)10000個細(xì)胞，CellQuest ModFitTM軟件分析單核細(xì)胞中TLR2、4的陽性率。
　　 2.2單核細(xì)胞TLR2、4mRNA的相對

6、表達(dá)
　　 2.2.1人外周血單核細(xì)胞：Ficoll-Hypaque密度梯度離心法提取重癥肺炎組、肺炎組及健康人外周血標(biāo)本中單個核細(xì)胞（PBMC），用黏附法方法分離純化單核細(xì)胞。
　　 2.2.2 單核細(xì)胞TLR2、4mRNA相對定量：參照TRIzol(美國invitrogen)說明書抽提總RNA，檢測所得總RNA的質(zhì)量和濃度。將從重癥肺炎、肺炎患者和健康對照者分離純化的單核細(xì)胞中提取的總RNA全部反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用

7、Power SYBR Green PCR Master Mix(ABI)定量PCR試劑盒，將TLR2、4和β-actin的陽性模板和健康對照者的cDNA同時在熒光定量PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后，電腦Sequence Detection System將樣本的擴(kuò)增曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，并結(jié)合內(nèi)參自動計算出各樣本的TLR2、4基因表達(dá)的拷貝數(shù)。
　　 2.3三組標(biāo)本血漿中TNF-α、IL-1β、IL-8表達(dá)水平。采用雙抗體夾心酶聯(lián)免

8、疫吸附法（ELISA）測定重癥肺炎、肺炎組及健康組中人TNF-α、IL-1β、IL-8的表達(dá)水平。
　　 2.4 統(tǒng)計學(xué)方法：所有實驗數(shù)據(jù)均用SPSS 13.0軟件分析，計量資料以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(士S)表示，各組數(shù)據(jù)用SPSS 13.0軟件分析呈正態(tài)分布，組與組之間的兩兩比較采用單因素方差分析，方差齊時采用LSD法；方差不齊采用Tamhane，s T2進(jìn)行多重比較；、PSI評分及血漿中TNF-α、IL-1β、IL-8濃度與TLR2

9、、TLR4之間的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析，取P<0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 3.1 外周血單核細(xì)胞上TLR-2、4陽性率
　　 與健康組對比，重癥肺炎組、肺炎組外周血單核細(xì)胞上TLR2、4陽性率均明顯升高（P<0.01）; 重癥肺炎組外周血單核細(xì)胞上TLR4陽性率較肺炎組明顯升高（P<0.01）.但兩組間TLR2陽性率無明顯差異（P>0.05）。
　　 3.2外周血中單核細(xì)胞中

10、TLR-2、4 mRNA的表達(dá)量
　　 肺炎組和重癥肺炎組外周血中單核細(xì)胞上TLR2、4mRNA表達(dá)量均較健康對照組明顯升高（P<0.01）；重癥肺炎組外周血中單核細(xì)胞上TLR4mRNA相對表達(dá)量較肺炎組明顯升高（P<0.01）; 但兩者組TLR2mRNA的相對表達(dá)量無明顯的差異（P>0.05）。
　　 3.3 重癥肺炎、肺炎及健康組血漿中TNF-α、IL-1β、IL-8水平
　　 肺炎和重癥肺炎患者血漿中TNF

11、-α、IL-1β、IL-8水平較健康組明顯升高（P<0.01），并且重癥肺炎組血漿中TNF-α、IL-1β、IL-8水平較肺炎組明顯升高（P<0.01），三組間兩兩比較有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 3.4患者血漿中TNF-α、IL-1β、IL-8表達(dá)水平及PSI評分與TLR2、4陽性率的相關(guān)性
　　 三組標(biāo)本外周血單核細(xì)胞TLR2、4陽性率與血漿中TNF-α、IL-1β、IL-8濃度均具有正相關(guān)性，另外TLR4與PSI評分具有正

12、相關(guān)性，決定系數(shù)R=0.517,P=0.003。
　　 結(jié)論：
　　 1.重癥肺炎外周血單核細(xì)胞TLR2、4mRNA表達(dá)上調(diào)引起TLR2、4蛋白表達(dá)升高。
　　 2.重癥肺炎患者血漿中TNF-α、IL-1β、IL-8濃度較肺炎組、健康組明顯升高，與TLR2、4均具有正相關(guān)，與外周血單核細(xì)胞TLR2、4基因表達(dá)上調(diào)存在相關(guān)。
　　 3.重癥肺炎患者外周血單核細(xì)胞TLR2、4蛋白表達(dá)較健康對照組明顯升高，重癥