ERβ水平影響他莫昔芬抗乳腺癌細胞作用的相關研究.pdf

1、研究背景：乳腺癌是危害婦女健康的最主要惡性腫瘤之一,據(jù)統(tǒng)計每年全球范圍內(nèi)大約有120萬婦女罹患乳腺癌,超過50萬人死于乳腺癌。在西歐、北美等發(fā)達國家和地區(qū),乳腺癌的發(fā)病率已占女性惡性腫瘤首位;在我國,雖乳腺癌發(fā)病率較低,但近些年來有明顯上升趨勢,并呈現(xiàn)出年輕化的趨勢。乳腺癌是一種激素誘發(fā)的腫瘤,根據(jù)這個特點進行內(nèi)分泌治療已有100多年的歷史。選擇將雌激素受體(estrogen receptor,ER)作為乳腺癌病人預后評估因子以及治療靶

2、點有著重要的臨床意義,腫瘤活檢檢測ER已經(jīng)成為選擇治療方案的常規(guī)檢測手段。目前,對ER陽性乳腺癌的第一線療法是雌激素受體拮抗劑,如他莫昔芬等藥物。但約有30％的患者在接受他莫昔芬類藥物內(nèi)分泌治療后并沒有取得明顯的治療效果,會出現(xiàn)原發(fā)或者繼發(fā)性耐藥現(xiàn)象,其抗藥耐藥原因目前不是很明確,近年來對其耐藥機制的研究也成為此方面學者研究的熱點。在繼發(fā)現(xiàn)了第一個雌激素受體ERα后約10年,1996年成功地克隆及鑒定了第二個雌激素受體ERβ。從而ERβ

3、的檢測,在乳腺癌中的潛在應用價值及在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、預后評估和內(nèi)分泌治療效果評估等方面的研究日益受到重視。但是目前,臨床實驗室采用免疫組織化學法檢測乳腺癌的ER表達水平時,使用的抗體大多只針對ERα或不能有效的區(qū)分ERα和ERβ。國內(nèi)外研究界關于ERβ在乳腺癌患者他莫昔芬耐藥中的作用研究非常少,而且各實驗小組的研究結果差異很大,甚至結論截然相反;能否將ERβ作為評估乳腺癌內(nèi)分泌治療預后的一個指標,也尚無定論。本課題旨在通過使用更加靈

4、敏、高效的方法改變?nèi)橄侔┘毎当旧淼腅Rβ水平,進而在此基礎上通過一系列實驗技術觀察細胞對他莫昔芬的反應性,以明確ERβ水平在他莫昔芬內(nèi)分泌治療耐藥中可能的作用,并試圖闡明其可能分子機制,進而為臨床更合理、有效應用雌激素受體拮抗劑等內(nèi)分泌藥物治療乳腺癌提供直接的、有價值的參考資料。實驗目的本實驗旨在通過使用更加靈敏、高效的方法改變?nèi)橄侔┘毎当旧淼腅Rβ水平,進而在此基礎上通過一系列實驗技術觀察這些細胞對他莫昔芬的反應性;以明確ERβ水

5、平在他莫昔芬內(nèi)分泌治療耐藥中可能的作用,并試圖闡明其可能的分子機制,進而為臨床更合理、有效應用雌激素受體拮抗劑等內(nèi)分泌藥物治療乳腺癌提供直接的、有價值的參考資料。
　　實驗方法：1.構建含人ERβ基因的重組慢病毒表達載體利用RT-PCR技術成功擴增克隆出人ERβ基因片段,然后利用一種克隆操作平臺Gateway技術,將目的基因連接到入門載體pENTRTM3C,再經(jīng)LR重組反應轉(zhuǎn)入到pLenti6.3/V5-DEST載體中,經(jīng)鑒定從而

6、成功構建含人雌激素受體ERβ基因的重組慢病毒表達載體pLenti-ERβ;自Sigma公司直接選購能有效沉默ERβ基因的慢病毒短發(fā)夾狀RNA(pLKO-shRNA),其沉默ERβ基因有效性均已經(jīng)得到驗證。2.將上述構建載體ERβ pLKO-shRNA,通過包裝質(zhì)粒psPAX2、包膜質(zhì)粒pMD2.G和干涉質(zhì)粒三質(zhì)粒體系包裝慢病毒,所得病毒液感染乳腺癌細胞株T47D和MCF-7;瞬轉(zhuǎn)48h,常規(guī)提取對應總RNA和蛋白經(jīng)過PCR、wester

7、n-blot鑒定,分別初篩選出對ERβ基因干涉效果明顯的靶點(每株細胞選出兩個靶點)并加一定濃度嘌呤霉素(puromycin1mg/L)連續(xù)加壓篩選4W;待細胞不再死亡(此時空白對照con組細胞已完全殺死),表明陽性克隆已形成。并再次分別從mRNA水平和蛋白水平驗證ERβ基因表達量。建立穩(wěn)定下調(diào)ERβ基因水平乳腺癌穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株T47D和MCF-7。3.以所構建穩(wěn)定下調(diào)ERβ基因的兩乳腺癌細胞株作為研究對象,分別從細胞增殖和凋亡等方面,觀察

8、乳腺癌細胞生物學特征及對他莫昔芬反應性的變化。涉及實驗方法有:MTT法(3-(4,5dimethyl thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,四甲基偶氮唑藍)、EdU法(5-ethynyl-2’-deoxyuridine,5-乙炔基-2,脫氧尿嘧啶核苷)、FCM(流式細胞技術)以及TUNEL法(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling,TdT介導的脫氧三磷

9、酸尿苷缺口末端標記法)等,在此基礎上,著重利用western-blot(蛋白免疫印跡)法從細胞凋亡相關分子入手,探究下調(diào)ERβ基因水平引起乳腺癌細胞對他莫昔芬反應性改變的可能分子機制。
　　實驗結果：1.構建含人ERβ基因的重組慢病毒表達載體所構建載體經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、PCR和基因測序鑒定結果顯示,已成功構建含人ERβ基因的重組慢病毒表達載體(pLenti-ERβ);針對靶向下調(diào)ERβ基因的pLKO-shRNA慢病毒表達載體的有效

10、性已由所購公司驗證。2.成功建立穩(wěn)定下調(diào)ERβ基因水平乳腺癌穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株T47D和MCF-7首先成功初篩選出干涉效果最明顯兩個靶點,即T47D細胞(pLKO-shRNA-3326/3327)和MCF-7細胞(pLKO-shRNA-3325/3326),并以此作后續(xù)實驗:加一定濃度嘌呤霉素連續(xù)加壓篩選4W后,mRNA水平和蛋白水平驗證ERβ表達量,RT-PCR結果顯示:與對照組相比,實驗組ERβ mRNA的表達明顯降低,兩細胞實驗組ERβ

11、mRNA下調(diào)率分別達(61.12±3.66)％、(76.47±3.16)％(T47D)和(62.42±0.07)％、(42.49±1.96)％(MCF-7);western-blot法檢測兩乳腺癌細胞株ERβ蛋白表達水平:所得兩細胞株各自對照組(con、scr)、實驗組(T47D-ERβ-s1/s2和MCF-7-ERβ-s1/s2) ERβ蛋白表達,經(jīng)軟件圖像分析,與對照組相比,實驗組ERβ蛋白表達量均有明顯降低:其中T47D-ERβ-

12、s1、s2兩組蛋白量分別下調(diào)率為(60.83±3.07)％和(53.31±3.00)％;MCF-7-ERβ-s1、s2兩組下調(diào)率達(83.69±5.07)％和(73.16±13.21)％。而陰性對照組與空白對照組相比,ERβ蛋白表達無明顯變化。以上結果均為3次測量結果。3.穩(wěn)定下調(diào)ERβ基因水平的兩株乳腺癌細胞株為基礎,分別從細胞增殖、凋亡等方面檢測在下調(diào)ERβ水平對乳腺癌細胞生物學特征、細胞對他莫昔芬反應性的影響:①MTT法檢測下調(diào)E

13、Rβ水平對乳腺癌細胞增殖及對TAM反應性影響兩株細胞系scramble、s1和s2三組細胞,不同濃度TAM作用48h, T47D細胞實驗組s1、s2自TAM10μM時開始,其細胞存活率明顯低于對照組(scramble),且在TAM為15μM時差異最為明顯(P<0.05);MCF-7細胞實驗組s1、s2自TAM5μM時開始,其細胞存活率開始低于對照組(scramble),且在TAM為10~15μM時差異最為明顯(P<0.05)。而兩實驗組

14、s1和s2之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。由此提示,下調(diào)ERβ水平可提高一定濃度TAM對乳腺癌細胞增殖的抑制性。②EdU法測定下調(diào)ERβ水平對乳腺癌細胞DNA變化EdU法檢測各組乳腺癌細胞株DNA增殖情況:在不加TAM時,T47D-s1/s2兩組細胞EdU標記陽性率高于T47D-scramble組;然而在15μM TAM作用48h后檢測結果顯示,T47D-s1/s2兩組細胞EdU標記陽性率幾乎為零,明顯低于T47D-scrambl

15、e組(P<0.05)。MCF-7-scramble、s1和s2三組細胞比較EdU標記陽性率,得到與T47D細胞類似的結果。由此提示,下調(diào)ERβ水平一定程度上可刺激乳腺癌細胞自身增殖,但卻可以增強癌細胞對TAM藥物的敏感性。③流式細胞術(FCM)檢測下調(diào)ERβ水平對乳腺癌細胞凋亡的影響FCM法檢測各組乳腺癌細胞凋亡情況:在不加TAM時,T47D-scramble/s1/s2三組細胞的細胞凋亡無明顯差異(P>0.05);在15μM TAM作

16、用48h后檢測結果顯示,T47D-s1/s2兩組細胞凋亡率明顯高于T47D-scramble組(P<0.05),兩實驗組間無明顯差異(P>0.05)。MCF-7-scramble、s1和s2三組細胞比較亦得到與T47D細胞類似的結果。上述結果提示,下調(diào)ERβ水平可以增強TAM藥物的誘導乳腺癌細胞凋亡作用。④TUNEL法測定兩株穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系各組細胞在TAM作用下細胞凋亡情況:其中T47D-s1和s2兩實驗組中凋亡細胞明顯多于對照組,差異有顯

17、著性(P<0.05);而MCF-7-s2實驗組中凋亡細胞數(shù)多于其他兩組,其中s2組與對照組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。⑤通過western blot檢測T47D-scramble/S1/S2三組細胞caspase-3及PARP的表達,TAM組中T47D-S1/S2兩組活化亞基cleved-caspase-3和PARP剪切片段85KD表達明顯大于對照組;而不加TAM組,三組細胞caspase-3及其活化亞基分子和PARP表達則無明

18、顯差異。
　　結論：1.雌激素受體(ER)陽性乳腺癌細胞株T47D和MCF-7,下調(diào)其ERβ基因表達量一定程度上可能刺激乳腺癌細胞本身的增殖,但卻可以增強癌細胞對TAM藥物的敏感性,表現(xiàn)為相同藥物濃度作用下,他莫昔芬對細胞增殖抑制作用增強,并且可明顯的誘導細胞凋亡。2.下調(diào)乳腺癌細胞ERβ基因表達水平增強癌細胞對TAM藥物的敏感性,其過程可能是通過增強如caspase-3等凋亡相關分子的剪切活化作用而引起細胞凋亡來實現(xiàn)的。據(jù)本實驗