他莫昔芬和四羥他莫昔芬誘導巨噬細胞中清道夫受體BI的表達.pdf

1、心血管疾病是人類健康的頭號殺手。而動脈粥樣硬化是冠心病形成的主要病因,其成因是脂質(zhì)在血管內(nèi)壁層下巨噬細胞中過度積累引起的巨噬細胞泡沫化并堆積形成斑塊,其過程也被認為是一種慢性炎癥反應。清道夫受體BI(scavenger receptor type BI,SR-BI)是高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)受體,在包括巨噬細胞在內(nèi)的多種細胞類型中高度表達,介導脂質(zhì)的雙向轉(zhuǎn)運。SR-BI的高表達能夠抑制動脈

2、粥樣硬化的發(fā)展,而敲除SR-BI則促進其發(fā)展。
　　 他莫昔芬(tamoxifen)是一種選擇性的雌激素受體調(diào)節(jié)劑(selective estrogenreceptor modulator,SERM),同時也是蛋白激酶C抑制劑和抗血管再生因子。它在細胞色素P450的作用下轉(zhuǎn)化為具有更高SERM活性的四羥他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen)。在乳腺癌細胞中tamoxifen可以經(jīng)由PAX2阻遏ERBB2基因表達,封閉雌

3、二醇誘導的血管內(nèi)皮生長因子的表達,從而有效地抑制乳腺癌細胞增生,達到治療乳腺癌的作用。動物及臨床實驗表明,tamoxifen可以預防心血管疾病,但作用機制仍有待研究。固本論文目的是研究tamoxifen是否通過上調(diào)SR-BI的表達從而抑制泡沫細胞的形成。
　　 在本項研究工作中,我們的實驗流程是這樣設(shè)計的:
　　 因材料獲得上的便利,我們首先在巨噬細胞系當中進行蛋白和RNA實驗,并進行3次以上的重復得到穩(wěn)定、可靠的結(jié)果,

4、為下一步進行原代細胞實驗及體內(nèi)實驗提供一定的經(jīng)驗與數(shù)據(jù)支持。但細胞系細胞基因表達譜會與原代細胞內(nèi)表達譜有所差別,有時細胞系得到的結(jié)果并不是體內(nèi)細胞發(fā)生的真實情況甚至會得到與真實情況相反的結(jié)論,因此有必要進行原代細胞實驗,并需要重復多次才可得到可靠的結(jié)論。在完成原代細胞實驗后要進行體內(nèi)實驗,除具有驗證前期結(jié)果的作用外,還要考察蛋白在體內(nèi)其功能是否在藥物處理后產(chǎn)生了怎樣的變化。因而我們先進行了細胞系內(nèi)的實驗。
　　 首先,我們分別研

5、究了tamoxifen和4-hydroxytamoxifen對雄性小鼠巨噬細胞系RAW264.7和雌性小鼠巨噬細胞系J774.A1中SR-BI表達的調(diào)控作用。Western blot實驗結(jié)果表明tamoxifen和4-hydroxytamoxifen能夠上調(diào)J774細胞系中SR-BI蛋白水平,而對RAW細胞系中SR-BI無影響作用。在小鼠腹腔巨噬細胞當中也得到相同的結(jié)果,tamoxifen/4-hydroxytamoxifen能夠上調(diào)來

6、自雌性小鼠原代巨噬細胞中SR-BI的表達,對雄性小鼠巨噬細胞無顯著影響。由此,可以推測tamoxifen和4-hydroxytamoxifen對SR-BI表達的影響作用是性別依賴性或雌激素受體依賴性的。為了驗證這項推測,我們分別檢測了雌二醇(雌激素受體α和雌激素受體β的共同激動劑)、ICI182780(雌激素受體抑制劑)、PPT(propylpyrazole triol,雌激素受體α特異性激動劑)和DPN[2,3-bis(4-hydro

7、xyphenyl)propionitrile,雌激素受體β特異性激動劑]對SR-BI表達的影響作用。結(jié)果顯示,在J774細胞系中雌二醇能夠提高SR-BI蛋白表達,ICI則抑制其表達。PPT能夠顯著上調(diào)SR-BI蛋白水平,而DPN則對J774中SR-BI無明顯影響作用。因此可以得出結(jié)論:實驗中對巨噬細胞中SR-BI表達的上調(diào)作用是雌激素受體α依賴性的。
　　 之后,我們研究了tamoxifen和4-hydroxytamoxifen

8、上調(diào)SR-BI的機理。我們發(fā)現(xiàn)它們對SR-BI mRNA和SR-BI啟動子活性均無明顯影響作用。這揭示了這種調(diào)節(jié)作用不發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。
　　 放線菌酮能夠抑制真核細胞蛋白合成,它是研究蛋白穩(wěn)定性的工具。在用放線菌酮和tamoxifen處理細胞后,得到結(jié)論:tamoxifen能夠增加SR-BI蛋白穩(wěn)定性。之后的體內(nèi)實驗證實:在肝細胞內(nèi),SR-BI并未被上調(diào),而在血清中,HDL含量有所升高。表明SR-BI的表達呈現(xiàn)組織、細胞的差異性