艾地苯醌對(duì)oxLDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面進(jìn)行了論述：
　　第一部分 艾地苯醌對(duì)氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用
　　目的：
　　探討艾地苯醌對(duì)氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響。
　　方法：
　　1.人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定。
　　2.觀察oxLDL對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的損傷以及艾地苯醌的作用。
　　結(jié)果：
　　1.在共聚焦顯微鏡下觀察培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞FactorⅧ Relat

2、ed Antigen及CD31高表達(dá)，證實(shí)所培養(yǎng)的細(xì)胞是血管內(nèi)皮細(xì)胞。
　　2.與正常組比較，100μg/ml oxLDL培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞可見細(xì)胞胞體縮小、皺縮，胞質(zhì)出現(xiàn)空泡，細(xì)胞表面出現(xiàn)黑色顆粒，核膜模糊，較多的細(xì)胞變圓脫落，有細(xì)胞破碎，未脫落細(xì)胞收縮變小，多有細(xì)長(zhǎng)突起相互牽連，出現(xiàn)凋亡改變，細(xì)胞增殖水平明顯下降(65.85±4.25％)(P＜0.01)。與oxLDL組比較，0.05μM，0.1μM，0.2μM艾地苯醌預(yù)處理組+10

3、0μg/ml oxLDL各組HUVECs細(xì)胞形態(tài)明顯改善，皺縮及懸浮細(xì)胞明顯減少，各組的細(xì)胞增殖水平明顯提高(分別是75.68±2.59％，78.24±2.12％，81.48±2.39％)(P＜0.05)。
　　3.各組細(xì)胞經(jīng)Hoechst33258染色后，oxLDL誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞核凋亡，有的細(xì)胞核呈濃染致密的固縮形態(tài)或顆粒狀熒光，有的細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體，細(xì)胞凋亡率明顯增加(P＜0.01)。與oxLDL組相比，艾

4、地苯醌預(yù)處理的HUVEC細(xì)胞中細(xì)胞核呈濃染致密的固縮形態(tài)或顆粒狀熒光的凋亡細(xì)胞數(shù)明顯減少，大部分細(xì)胞染色質(zhì)呈彌漫均勻低強(qiáng)度熒光，細(xì)胞凋亡率明顯下降(P＜0.05)。
　　4.與正常組相比，100μg/ml oxLDL組HUVECs Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低，Bax蛋白表達(dá)明顯增高，cleaved caspase-3表達(dá)明顯增高(P＜0.01)。與oxLDL組比較，0.05μm、0.1μm、0.2μm艾地苯醌預(yù)處理+100μg/m

5、l oxLDL組HUVECs Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯增高，Bax蛋白、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05)。提示艾地苯醌可以通過(guò)穩(wěn)定Bcl-2，抑制Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，保護(hù)受損的血管內(nèi)皮細(xì)胞。
　　結(jié)論：
　　在體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中，艾地苯醌預(yù)處理在一定的濃度下，能夠明顯抑制氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其可以通過(guò)穩(wěn)定Bcl-2，抑

6、制Bax、cleaved caspase-3表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，保護(hù)受損的血管內(nèi)皮細(xì)胞。
　　第二部分 艾地苯醌對(duì)氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)機(jī)制研究
　　目的：
　　研究艾地苯醌對(duì)氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的早期血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的保護(hù)機(jī)制，探討GSK3β、β-catenin蛋白在此過(guò)程中作用。
　　方法：
　　1.研究艾地苯醌對(duì)線粒體功能的影響。
　　2.研究艾地苯醌對(duì)GSK3β、

7、β-catenin信號(hào)蛋白的影響。
　　結(jié)果：
　　1.與正常組相比，100μg/ml oxLDL組內(nèi)皮細(xì)胞生成MDA量顯著增高(3.34±0.23 nmol/mg protein vs1.48±0.14 nmol/mg protein)，SOD活力顯著降低(2.12±0.18 unit/mg protein vs4.36±0.31 unit/mg protein)(P＜0.01)。
　　與100μg/ml oxLDL

8、組相比，0.05μM、0.1μM、0.2μM的艾地苯醌預(yù)處理+100μg/ml oxLDL的各組MDA生成量均明顯降低(分別是2.72±0.28 nmol/mgprotein，2.41±0.15 nmol/mg protein,2.26±0.13 nmol/mg protein)，SOD活力均明顯增高(分別是3.05±0.25 unit/mg protein，3.33±0.23 unit/mg protein，3.59±0.21 uni

9、t/mgprotein)(P＜0.01)，提示艾地苯醌可以通過(guò)抑制細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化，增強(qiáng)細(xì)胞清除氧自由基能力，保護(hù)oxLDL損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞。
　　2.與正常細(xì)胞組相比，oxLDL組紅色熒光(JC-1聚合體)明顯減弱，紅綠熒光比值顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01），間接反映線粒體膜電位△Ψm顯著降低。與100μg/ml oxLDL組內(nèi)皮細(xì)胞相比，加用0.05μM、0.1μM、0.2μM的艾地苯醌預(yù)處理+100μg/ml o

10、xLDL的各組紅色熒光強(qiáng)度明顯增加，紅綠熒光比值顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　與正常組相比，100μg/ml oxLDL組血管內(nèi)皮細(xì)胞ATP水平顯著降低(8.83±1.71μmol/mg protein vs23.82±3.43μmol/mg protein)(P＜0.01)。與100μg/mloxLDL組血管內(nèi)皮細(xì)胞比較，0.05μM、0.1μM、0.2μM終濃度的艾地苯醌+oxLDL100μg/ml組內(nèi)皮細(xì)

11、胞ATP水平均明顯升高(分別為15.16±2.19μmol/mgprotein，16.37±3.51μmol/mg protein，17.12±2.06μmol/mg protein)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。
　　與正常組相比，100μg/ml oxLDL組HUVECs線粒體細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)水平明顯降低，胞漿細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)水平明顯增高(P＜0.01），提示細(xì)胞色素C從細(xì)胞線粒體中釋放到細(xì)胞漿中，說(shuō)明oxLDL通過(guò)細(xì)

12、胞線粒體凋亡通路引起細(xì)胞凋亡。與oxLDL組比較，分別用0.05μM、0.1μM、0.2μM的艾地苯醌預(yù)處理2小時(shí)+100μ g/ml oxLDL組，線粒體細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)水平明顯增高，胞漿細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05)。
　　3.與正常組比較，100μg/ml oxLDL組的P-GSK3β(Ser9)明顯降低，上調(diào)GSK3β活性，使P-β-catenin(Ser33/37/Thr41)含量明顯增加，胞漿β-ca

13、tenin蛋白表達(dá)水平明顯增加，胞核β-catenin蛋白表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05），影響GSK3β、β-catenin通路的信號(hào)傳導(dǎo)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。與100μg/ml oxLDL組比較，0.2μM艾地苯醌+100μg/ml oxLDL組的P-GSK3β(Ser9)蛋白表達(dá)水平明顯增加，使GSK3β失活，P-β-Catenin(Ser33/37/Thr41)蛋白表達(dá)水平明顯降低，同時(shí)伴隨著胞漿β-catenin蛋白表達(dá)明顯降低和胞

14、核β-catenin蛋白表達(dá)水平明顯增加，使β-catenin核內(nèi)聚集(P＜0.05)。與10mM LiCL處理做為陽(yáng)性對(duì)照一致，β-catenin核內(nèi)聚集與GSK3β的活性有關(guān)。四組之間比較細(xì)胞的總蛋白的GSK3β、β-catenin蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯差異(P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.在體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中，艾地苯醌通過(guò)抑制oxLDL誘導(dǎo)的細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化，增強(qiáng)細(xì)胞清除氧自由基能力，抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)。<

15、br>　　2.早期艾地苯醌干預(yù)通過(guò)改善氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的線粒體膜電位下降，增加細(xì)胞ATP生成量，改善線粒體功能，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的線粒體凋亡通路，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。
　　3.早期艾地苯醌干預(yù)可以使P-GSK3β(Ser9)明顯增加，使GSK3β失活，失活的GSK3β影響下游β-catenin的磷酸化，P-β-Catenin(Ser33/37/Thr41)含量降低，促進(jìn)β-catenin從細(xì)胞漿向細(xì)