烏司他丁對(duì)膿毒癥誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　 探討烏司他丁對(duì)膿毒癥誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用及其機(jī)制。
　　 方法：
　　 體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，將HUVEC接種于transwell培養(yǎng)板上層小室，建立完整的內(nèi)皮細(xì)胞單層模型。隨機(jī)分成正常血清組、PBS組、膿毒癥組、人重組基質(zhì)金屬蛋白酶－9(MMP9)組、膿毒癥+烏司他丁(UTI)組、MMP9+UTI組共六組。正常血清組、PBS組、膿毒癥組是在transwell上層小室內(nèi)分別加

2、入正常血清、PBS液、膿毒癥血清，最終濃度均為10％，MMP9組transwell上層小室內(nèi)加入等體積的MMP9稀釋液，使其最終濃度1ug/ml，膿毒癥+UTI組、UMP9+UTI組分別加入膿毒癥血清、MMP9稀釋液(劑量同膿毒癥組和MMP9組)，補(bǔ)充DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時(shí)后，棄掉培養(yǎng)液，于上層小室內(nèi)加入烏司他丁，使其最終濃度1000u/ml，其他四組加入等體積PBS液，然后進(jìn)行如下操作：1、各組上層小室內(nèi)加入異硫氰酸熒光素(FIT

3、C)標(biāo)記的葡聚糖(40KD)，濃度為10ug/ml，補(bǔ)充培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，從上、下室抽取培養(yǎng)液應(yīng)用熒光光譜儀檢測(cè)FITC的熒光發(fā)射強(qiáng)度，通透性以下室熒光強(qiáng)度/(上室熒光強(qiáng)度×面積×?xí)r間)×100％表示，觀察烏司他丁對(duì)膿毒癥血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響；2、補(bǔ)充培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)法檢測(cè)各組transwell上下層小室內(nèi)培養(yǎng)液中可溶性血管鈣黏蛋白(VE-cadherin)濃度，觀察烏司他丁對(duì)膿毒癥

4、血管內(nèi)皮細(xì)胞可溶性VE-cadherin濃度的影響；3、補(bǔ)充培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，采用免疫印跡法(Westernblot)和免疫熒光法檢測(cè)VF-cadherin、claudin-5和ZO-1蛋白含量，分析烏司他丁對(duì)膿毒癥血管內(nèi)皮細(xì)胞連接蛋白VE-cadherin、claudin-5和ZO-1表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1、檢測(cè)烏司他丁對(duì)膿毒癥血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響：正常血清組血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性為1.00±0.

5、16(％.cm-2.h-1)；膿毒癥組血管內(nèi)皮通透性為1.78±0.13(％.cm-2.h-1)，顯著高于正常血清組(P<0.001)；膿毒癥+UTI組血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性為1.23±0.28(％.cm-2.h-1)，顯著低于膿毒癥組(P<0.001)。PBS組血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性為0.94±0.57(％.cm-2.h-1)；MMP9組血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性為3.35±0.56(％.cm-2.h-1)，明顯高于PBS組(P<0.001)；MMP

6、9+UTI組血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性為1.80±0.34(％.cm-2.h-1)，顯著低于MMP9組(P<0.001)。
　　 2、檢測(cè)烏司他丁對(duì)膿毒癥血管內(nèi)皮細(xì)胞可溶性VE-cadherin濃度的影響：(1)正常血清組transwell培養(yǎng)板上層小室可溶性VE-cadherin濃度3.84±0.31ng/ml，正常血清組下層小室可溶性VE-cadherin濃度3.08±1.48ng/ml；(2)膿毒癥組上層小室可溶性VE-cadhe

7、rin濃度5.03±0.40ng/ml，明顯高于正常血清組(P<0.001)，膿毒癥組下層小室可溶性VE-cadherin濃度4.82±1.05ng/ml，明顯高于正常血清組(P=0.001)；(3)膿毒癥+UTI組上層小室可溶性VE-cadherin濃度4.44±0.44ng/ml，明顯低于膿毒癥組(p=0.001)，膿毒癥+UTI組下層小室可溶性VE-cadherin濃度3.78±0.91ng/ml，明顯低于膿毒癥組(p=0.036

8、)；(4)PBS組上層小室可溶性VE-cadherin濃度3.83±0.42ng/ml，PBS組下層小室可溶性VE-cadherin濃度3.24±1.24ng/ml；(5)MMP9組上層小室可溶性VE-cadherin濃度5.02±0.40ng/ml，明顯高于PBS組(p<0.001)，MMP9組下層小室可溶性VE-cadherin濃度4.92±1.05ng/ml，明顯高于PBS組(p=0.001)；(6)MMP9+UTI組上層小室可溶

9、性VE-cadherin濃度4.41±0.37ng/ml，明顯低于MMP9組(P=0.001)，MMP9+UTI組下層小室可溶性VE-cadherin濃度3.85±1.04ng/ml，明顯低于MMP9組(P=0.033)。
　　 3、通過Westernblot法觀察烏司他丁對(duì)膿毒癥血管內(nèi)皮細(xì)胞連接蛋白VE-cadherin、claudin-5和ZO-1表達(dá)的影響：與正常血清和PBS對(duì)照組相比，膿毒癥組、MMP9組VE-cadhe

10、rin、claudin-5和ZO-1蛋白表達(dá)量明顯減少，膿毒癥+UTI組、MMP9+UTI組VE-cadherin、claudin-5和ZO-1的表達(dá)量比膿毒癥組、MMP9組明顯增加。
　　 4、通過免疫熒光法觀察烏司他丁對(duì)膿毒癥血管內(nèi)皮細(xì)胞連接蛋白VE-cadherin、claudin-5和ZO-1表達(dá)的影響：正常血清組及PBS組VE-cadherin、claudin-5和ZO-1等蛋白的熒光圖案連續(xù)，膿毒癥組、MMP9組VE

11、-cadherin、claudin-5和ZO-1蛋白的熒光圖案出現(xiàn)明顯斷裂，熒光顆粒明顯減少，膿毒癥+UTI組、MMP9+UTI組VE-cadherin、claudin-5和ZO-1蛋白的熒光圖案比膿毒癥組、MMP9組更連續(xù)，熒光顆粒明顯增加。
　　 結(jié)論：
　　 烏司他丁對(duì)膿毒癥誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過抑制MMP9，對(duì)膿毒癥中多種炎性因子的進(jìn)行調(diào)節(jié)，避免膿毒癥的過度炎癥反應(yīng)造成的細(xì)胞連蛋白脫