自噬在尼古丁誘導的血管內皮細胞損傷中的作用研究.pdf

1、目的：
　　本研究以原代人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)為對象，采用尼古丁干預，明確尼古丁刺激對人臍靜脈內皮細胞自噬功能影響，探討自噬在尼古丁誘導的內皮細胞損傷中的作用及其可能機制。
　　方法：
　　人臍靜脈內皮細胞經(jīng)不同濃度尼古丁干預6h，采用WesternBlot蛋白免疫印跡技術檢測細胞中自噬標記蛋白LC3Ⅱ及自噬相關蛋白Beclin-1、SQSTM1/p62和LAMP-2蛋白表達水平；WesternBlot檢測6×

2、10-8M及6×10-6M尼古丁作用于HUVEC不同時間(0h、1.5h、3h、6h、12h)時LC3Ⅱ、SQSTM1/p62和LAMP-2蛋白表達變化；采用流式細胞術檢測6×10-6M、6×10-8M尼古丁干預人臍靜脈內皮細胞6h時的凋亡率；運用基因沉默技術敲除HUVECs中AMPKα基因，利用WesternBlot技術檢測LC3Ⅱ和AMPKα蛋白表達，運用流式細胞術檢測細胞凋亡率。
　　結果：
　　1.不同濃度尼古丁干預

3、HUVECs時，LC3Ⅱ蛋白表達具有濃度依賴性呈上調趨勢，6×10-6M尼古丁作用下LC3Ⅱ蛋白表達顯著升高(P<0.01)。然而，Beclin-1表達與LC3Ⅱ的變化并不完全一致：低濃度尼古丁(6×10-9M、6×10-8M)作用下Beclin-1與對照組相比升高(P<0.01)，高濃度下(6×10-7M和6×10-6M)Beclin-1與對照組相比降低(P<0.01)。LAMP-2蛋白表達與Beclin-1變化一致。有趣的是，SQS

4、TM1/p62蛋白表達與Beclin-1、LAMP-2完全相反。
　　2.6×10-8M、6×10-6M尼古丁分別干預HUVEC不同時間段，LC3Ⅱ蛋白在6h處表達水平升高顯著(P<0.01)。同時，6×10-6M尼古丁干預下LAMP-2表達下調明顯，SQSTM1/p62蛋白表達升高顯著(P<0.01)，然而，6×10-8M尼古丁干預下LAMP-2與SQSTM1/p62蛋白表達變化與6×10-8M尼古丁干預時相反。
　　3.

5、6×10-8M尼古丁處理組與對照組相比，凋亡率差異不具有統(tǒng)計學意義(P?0.05)；6×10-6M尼古丁處理組與對照組相比，凋亡率顯著升高(P<0.001)；6×10-6M尼古丁處理組與6×10-8M尼古丁處理組相比，凋亡率顯著升高(P<0.001)。
　　4.尼古丁可磷酸化AMPKα。基因沉默AMPKα后發(fā)現(xiàn)，6×10-8M尼古丁+AMPKαsiRNA(AMPKsiRNA)實驗組與6×10-8M(consiRNA)尼古丁實驗組相