自噬在尼古丁誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用研究.pdf

1、目的：
　　本研究以原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)為對象，采用尼古丁干預(yù)，明確尼古丁刺激對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞自噬功能影響，探討自噬在尼古丁誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用及其可能機制。
　　方法：
　　人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)不同濃度尼古丁干預(yù)6h，采用WesternBlot蛋白免疫印跡技術(shù)檢測細(xì)胞中自噬標(biāo)記蛋白LC3Ⅱ及自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、SQSTM1/p62和LAMP-2蛋白表達水平；WesternBlot檢測6×

2、10-8M及6×10-6M尼古丁作用于HUVEC不同時間(0h、1.5h、3h、6h、12h)時LC3Ⅱ、SQSTM1/p62和LAMP-2蛋白表達變化；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測6×10-6M、6×10-8M尼古丁干預(yù)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞6h時的凋亡率；運用基因沉默技術(shù)敲除HUVECs中AMPKα基因，利用WesternBlot技術(shù)檢測LC3Ⅱ和AMPKα蛋白表達，運用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。
　　結(jié)果：
　　1.不同濃度尼古丁干預(yù)

3、HUVECs時，LC3Ⅱ蛋白表達具有濃度依賴性呈上調(diào)趨勢，6×10-6M尼古丁作用下LC3Ⅱ蛋白表達顯著升高(P<0.01)。然而，Beclin-1表達與LC3Ⅱ的變化并不完全一致：低濃度尼古丁(6×10-9M、6×10-8M)作用下Beclin-1與對照組相比升高(P<0.01)，高濃度下(6×10-7M和6×10-6M)Beclin-1與對照組相比降低(P<0.01)。LAMP-2蛋白表達與Beclin-1變化一致。有趣的是，SQS

4、TM1/p62蛋白表達與Beclin-1、LAMP-2完全相反。
　　2.6×10-8M、6×10-6M尼古丁分別干預(yù)HUVEC不同時間段，LC3Ⅱ蛋白在6h處表達水平升高顯著(P<0.01)。同時，6×10-6M尼古丁干預(yù)下LAMP-2表達下調(diào)明顯，SQSTM1/p62蛋白表達升高顯著(P<0.01)，然而，6×10-8M尼古丁干預(yù)下LAMP-2與SQSTM1/p62蛋白表達變化與6×10-8M尼古丁干預(yù)時相反。
　　3.

5、6×10-8M尼古丁處理組與對照組相比，凋亡率差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P?0.05)；6×10-6M尼古丁處理組與對照組相比，凋亡率顯著升高(P<0.001)；6×10-6M尼古丁處理組與6×10-8M尼古丁處理組相比，凋亡率顯著升高(P<0.001)。
　　4.尼古丁可磷酸化AMPKα?；虺聊珹MPKα后發(fā)現(xiàn)，6×10-8M尼古丁+AMPKαsiRNA(AMPKsiRNA)實驗組與6×10-8M(consiRNA)尼古丁實驗組相