以hTERT為靶點設計合成的新型二氫吡唑類化合物抑制人肝癌細胞株SMMC-7721增殖的作用機制研究.pdf

1、人端粒酶是由人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶催化亞單位(hTERT)、人端粒酶RNA(hTR)以及人端粒酶相關蛋白(hTP1)等部分組成。端粒酶自1994年被發(fā)現(xiàn)以來，由于其在負責維持染色體完整性、細胞永生化以及腫瘤發(fā)生發(fā)展方面的關鍵作用而被廣泛研究。因此，以端粒酶作為抗腫瘤藥物篩選的新靶點成為了當下研究的熱點，人們雖已發(fā)現(xiàn)或者設計合成了具備一定作用的抑制劑，但由于直到2008年端粒酶的晶體結構才被確認，以hTERT為作用靶點的高選擇性和高效的先導結構

2、及其藥理學作用機制研究至今仍然很少有報道。因此，本課題組基于端粒酶hTERT蛋白的晶體結構和潛在活性中心，初步建立了分子對接模型，虛擬篩選出了一些高活性的骨架結構，并以此為骨架基礎設計合成了一系列小分子化合物。同時對這一系列合成的小分子化合物進行抗癌活性篩選和藥理學機制研究。本課題的主要研究內(nèi)容如下：
　　1.目標化合物設計與合成
　　基于端粒酶hTERT蛋白的晶體結構和潛在活性中心，初步建立了該抑制劑的分子對接模型，虛擬篩

3、選出了一些高活性的骨架結構的化合物，并通過藥物化學的方法合成出這一系列化合物。
　　2.檢測小分子化合物對腫瘤細胞株增殖的影響
　　對設計合成的小分子化合物進行抗癌活性篩選：在人肝癌細胞株SMMC-7721、人肝癌細胞株 HepG2、人胃癌細胞株 MGC-803以及人乳腺癌細胞株MCF-7上進行MTT實驗，結果發(fā)現(xiàn)這一系列化合物中化合物4a對SMMC-7721腫瘤細胞的增殖作用抑制效果最明顯。同時，通過流式細胞術觀察化合物4

4、a對SMMC-7721腫瘤細胞周期的影響，實驗發(fā)現(xiàn) SMMC-7721細胞經(jīng)化合物4a處理48 h后S期細胞數(shù)顯著增多，而在G0/G1期細胞顯著減少，這提示化合物4a是通過阻滯細胞于S期實現(xiàn)抑制細胞增殖作用的。
　　3.檢測化合物4a對端粒酶活性以及hTERT的作用
　　通過改良的 TRAP實驗法檢測腫瘤細胞中端粒酶活性：實驗結果顯示，化合物4a對端粒酶活性亦表現(xiàn)出較強的抑制作用，IC50值為7.81±1.32μM。同時通過

5、Western blot實驗檢測hTERT蛋白表達變化，結果顯示用化合物4a處理細胞48 h后hTERT蛋白的表達量下降。提示化合物4a對hTERT蛋白以及端粒酶活性具有較強的抑制作用。
　　4.檢測化合物4a對NF-κb/P65信號通路的影響，檢測P65、IL-6以及TNF-α表達的變化
　　通過Q-PCR及Western blot實驗，發(fā)現(xiàn)化合物4a對 SMMC-7721肝癌細胞中NF-κb信號通路中關鍵分子P65的蛋白

6、表達及其下游的信號分子如IL-6和TNF-αmRNA和蛋白的表達具有下調(diào)作用，這提示化合物4a抑制SMMC-7721細胞增殖作用可能與NF-κb/P65信號通路有關。
　　5.過表達hTERT，檢測化合物4a對NF-κb/P65信號通路中P65、IL-6、TNF-α的影響。
　　Werstern blot以及Q-PCR實驗結果發(fā)現(xiàn)，過表達組P65蛋白表達以及IL-6和TNF-αmRNA和蛋白的表達量明顯增多，用化合物4a處理

7、48 h后表達量明顯下降，這提示人肝癌細胞株SMMC-7721中隨著hTERT表達量的升高，P65蛋白表達以及IL-6和TNF-α mRNA和蛋白的表達水平明顯上調(diào)，同時化合物4a對P65蛋白表達以及IL-6和TNF-αmRNA和蛋白的表達水平具有明顯下調(diào)的作用。該結果進一步提示通過作用于hTERT，化合物4a對下游NF-κb/P65信號通路產(chǎn)生作用從而抑制SMMC-7721肝癌細胞增殖。
　　綜上所述，本課題組以分子對接模型篩選

8、出的靶向hTERT的高活性骨架結構——N-砜基-芳基二氫吡唑為基礎，設計、合成了一系列新型二氫吡唑類化合物，同時通過藥理學實驗方法篩選出了一個潛在的小分子抑制劑——化合物4a，并對其可能的藥理學作用機制進一步研究探討。一系列實驗結果發(fā)現(xiàn)通過靶向 hTERT抑制端粒酶活性，化合物4a將SMMC-7721肝癌細胞阻滯于S期，實現(xiàn)抑制細胞增殖的目的。同時發(fā)現(xiàn)這種作用的實現(xiàn)可能和細胞增殖活化相關的 NF-κb/P65經(jīng)典信號通路的下調(diào)密切相關。