MOB2在肝癌細(xì)胞SMMC-7721的作用.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、本文從以下三部分進行了研究:
   第一部分 MOB2在肝細(xì)胞癌的表達及其意義
   目的:研究原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌(HCC)中MOB2的表達及其與HCC臨床病理特征關(guān)系。
   方法:采用免疫組織化學(xué)法檢測50例肝癌及其癌旁組織中MOB2蛋白表達情況,并分析其與肝細(xì)胞癌的臨床病理因素之間的關(guān)系。
   結(jié)果:免疫組化結(jié)果顯示50例肝癌組織中MOB2蛋白陽性表達率為40%,相對應(yīng)的癌旁組織MOB2的蛋白表達為

2、96%。肝癌組織中MOB2的表達明顯低于相應(yīng)的癌旁組織,其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,(P<0.05)。MOB2在肝癌組織蛋白表達率明顯低于癌旁組織,(P<0.05);MOB2蛋白在肝癌組織中的表達與性別、腫瘤大小、AFP水平、患者血清HBsAg是否陽性、Edmondson分級、有無門靜脈癌栓無關(guān)(P>0.05)。
   結(jié)論:MOB2蛋白缺失可能與肝癌細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移過程有關(guān)。MOB2有望成為一個新的分子指標(biāo),可用于肝細(xì)胞

3、癌的診斷、治療和監(jiān)測患者的預(yù)后。
   第二部分 MOB2真核表達載體的構(gòu)建
   目的:從人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞提取總RNA,利用RT-PCR法反應(yīng)獲得目的基因MOB2的cDNA片段,構(gòu)建具備可進行細(xì)胞轉(zhuǎn)染和容易被識別篩選的pEGFP-Cl-MOB2質(zhì)粒載體。
   方法:應(yīng)用Trizol法從人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中提取mRNA,按照GeneBank公布的MOB2基因序列設(shè)計引物:5’端引物:5,-CCCAAGCTTCCA

4、TGGACTGGCTCATGGGGAAGTC-3’;下游引物:5’-CGGGGTACCTCATCTCCTTCACGTGGTTCTG-3’。RT-PCR反應(yīng)獲得734bp大小的MOB2cDNA片段。MOB2和載體pEGFP-Cl用Hindlll、KpnI進行雙酶切,二者進行連接,構(gòu)建包含目的基因MOB2的重組質(zhì)粒pEGFP-Cl-MOB2。
   結(jié)果:使用Trizol法分離和提取得到人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞提取總RNA,通過RT-PCR

5、法反應(yīng)獲得目的基因MOB2的cDNA片段,構(gòu)建完成了能夠穩(wěn)定表達和具有篩選特征的pEGFP-Cl-MOB2質(zhì)粒載體,供后續(xù)轉(zhuǎn)染和表達實驗使用。
   結(jié)論:Trizol法簡便快速提取到人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞提取總RNA,RT-PCR法準(zhǔn)確地獲得目的基因MOB2的cDNA片段,正確構(gòu)建完成了pEGFP-Cl-MOB2質(zhì)粒載體
   第三部分重組表達載體的轉(zhuǎn)染及其對肝癌細(xì)胞SMMC-7721的生長的影響
   目的:對重組

6、pEGFP-Cl-MOB2質(zhì)粒載體進行擴增、純化,將重組載體轉(zhuǎn)染入肝癌SMMC-7721細(xì)胞中,篩選出陽性細(xì)胞克?。徊⒀芯哭D(zhuǎn)染MOB2對SMMC-7721細(xì)胞的生長和侵襲力是否會受到影響,是否會有顯著的細(xì)胞凋亡出現(xiàn),探討MOB2是否會影響SMMC-7721的細(xì)胞周期進展和分布比例,以判斷MOB2在肝細(xì)胞癌的發(fā)生和進展方面是否扮演著關(guān)鍵性的作用。
   方法:采用脂質(zhì)體Lipofectamine2000介導(dǎo)pEGFP-Cl-MOB

7、2在肝癌SMMC-7721細(xì)胞處于對數(shù)生長期進行轉(zhuǎn)染,并采用含G418的培養(yǎng)基篩選一獲得陽性克隆的整合了基因的MOB2基因的SMMC-7721細(xì)胞,繼續(xù)傳代培養(yǎng)。Westernblot檢測轉(zhuǎn)染前后MOB2蛋白量,MTT法檢測細(xì)胞增殖變化,Transwell小室測定細(xì)胞的體外侵襲能力。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期變化情況。軟瓊脂克隆形成實驗檢測細(xì)胞體外成瘤實驗。
   結(jié)果:轉(zhuǎn)染MOB2基因后肝癌SMMC-7721細(xì)胞的生長

8、增殖受到了顯著的抑制,說明轉(zhuǎn)染MOB2可以起到抑制肝癌細(xì)胞的過度增長;轉(zhuǎn)染MOB2基因后肝癌SMMC-7721細(xì)胞的侵襲能力顯著降低,說明轉(zhuǎn)染抑癌基因MOB2可以抑制肝癌SMMC-7721細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。
   結(jié)論:重組質(zhì)粒pEGFP-Cl-MOB2成功轉(zhuǎn)染肝癌SMMC-7721細(xì)胞,篩選獲得包含MOB2的陽性克隆SMMC-7721細(xì)胞。轉(zhuǎn)染MOB2基因后SMMC-7721細(xì)胞生長增殖受到顯著的抑制、遷移能力下降,MOB2

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