鱷膽素聯(lián)合阿霉素對人肝癌細(xì)胞smmc-7721抑制作用

1、1鱷膽素聯(lián)合阿霉素對人肝癌細(xì)胞鱷膽素聯(lián)合阿霉素對人肝癌細(xì)胞SMMC7721抑制作用抑制作用鄧軼韜1，丁玉梅1，李華亮1，2，董欣2，沈雪瑩1，陳清西1（1廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廈門361005；2廣州鼉龍生物技術(shù)開發(fā)有限公司）摘要摘要本文研究了鱷膽素（crocodilecholine）聯(lián)合阿霉素（doxubicin）對人肝癌細(xì)胞SMMC7721的體外抑制作用以不同濃度鱷膽素、阿霉素單用藥組和兩藥聯(lián)合用藥組作用SMMC7721細(xì)胞，應(yīng)用M

2、TT法和集落形成實驗檢測細(xì)胞增殖抑制、流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期分布、Westernblot檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果顯示鱷膽素、阿霉素單藥與聯(lián)合均能抑制SMMC7721細(xì)胞的增殖，且呈劑量依賴效應(yīng)，兩藥聯(lián)合有協(xié)同效應(yīng)（P＜0.01）集落形成實驗中對照組、鱷膽素單用藥組和阿霉素單用藥組的克隆形成率分別為88%、30.8%和28.5%，而兩藥聯(lián)合后幾乎沒有克隆形成，表明兩藥聯(lián)合有顯著的差異細(xì)胞周期分析顯示藥物處理組出現(xiàn)S期阻滯，聯(lián)合組與對照組相

3、比，S期細(xì)胞含量由12%上升到59%；各組均能誘導(dǎo)SMMC7721細(xì)胞凋亡，并以聯(lián)合組效果更佳，細(xì)胞核經(jīng)Hoechst染色出現(xiàn)濃染致密的固縮形態(tài)和強藍(lán)色熒光細(xì)胞中促凋亡蛋白Bax表達(dá)上調(diào)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡研究結(jié)果表明鱷膽素與阿霉素聯(lián)合對人肝癌細(xì)胞SMMC7721有顯著的抑制作用，作用效果具有協(xié)同效應(yīng)本研究有望為肝癌的聯(lián)合用藥治療提供理論依據(jù)關(guān)鍵詞：關(guān)鍵詞：鱷膽素；阿霉素；聯(lián)合用藥；肝癌；細(xì)胞凋亡中圖分類號中圖分類號：Q3561文獻(xiàn)標(biāo)識碼文獻(xiàn)標(biāo)

4、識碼：A通訊作者：chenqx@xmu.（陳清西）基金項目：廈門市科技計劃項目：3502Z20133009，國家自然科學(xué)基金委基礎(chǔ)科學(xué)人才培養(yǎng)基金科研訓(xùn)練及科研能力提高項目(廈門大學(xué))（基金號：No.J1310027）和廈門大學(xué)生物學(xué)科拔尖計劃項目資助3RPMI1640培養(yǎng)基（pH7.2），37℃，體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗根據(jù)對細(xì)胞處理的藥物種類及濃度進(jìn)行分組，即對照組，鱷膽素、阿霉素單獨用藥組和鱷膽素、阿霉素

5、聯(lián)合用藥組鱷膽素單獨用藥組的終濃度依次為5、10、15、20μgmL；阿霉素單獨用藥組的終濃度依次為0.1、0.2、0.4、0.8和1.0μgmL聯(lián)合組用藥組的最終濃度依次為：阿霉素（0.2、0.4、0.8和1.0μgmL）鱷膽素（5μgmL），阿霉素（0.2、0.4、0.8和1.0μgmL）鱷膽素(10μgmL)和阿霉素（0.2、0.4、0.8、10μgmL）鱷膽素（15μgmL）1.2.2MTT法測定鱷膽素和阿霉素單獨或聯(lián)合作用對法

6、測定鱷膽素和阿霉素單獨或聯(lián)合作用對SMMC7721細(xì)胞細(xì)胞增殖增殖的影響的影響用MTT法測定鱷膽素單藥組、阿霉素單藥組和兩藥聯(lián)合組對SMMC7721細(xì)胞的抑制率取對數(shù)生長期的細(xì)胞以6103孔密度接種于96孔板，每個濃度設(shè)置4個重復(fù)，每孔加入200μL細(xì)胞懸液，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，分別加入2μL不同濃度的藥液，對照組加入相同體積的DMSO，繼續(xù)培養(yǎng)24h后加入20μLMTT溶液（5mgmL），培養(yǎng)4h，棄上清液，每孔再加入15

7、0μL二甲基亞砜（DMSO），37℃充分溶解后，用酶標(biāo)儀測定吸光度，測定波長為490nm按下式計算抑制率：抑制率（%）=（對照組OD值－實驗組OD值）對照組OD值100%1.2.3藥物聯(lián)合作用評價藥物聯(lián)合作用評價采用金氏公式｛q=Eab(EaEb)EaEb｝判斷兩藥不同藥物濃度相互作用是否具有協(xié)同作用，式中Eab為合用藥物的抑制率，Ea、Eb分別為a藥、b藥單獨用藥的抑制率若q值在0.85～1.15內(nèi)為兩藥合用單純相加，q值＞1.15為

8、有協(xié)同作用，q值＜0.85則表示兩藥合用有拮抗作用1.2.4集落形成實驗集落形成實驗取對數(shù)生長期的SMMC7721細(xì)胞，分別以每孔2000個細(xì)胞接種于60mm的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁后，分別用鱷膽素、阿霉素及兩者聯(lián)合處理細(xì)胞24h接著撤走藥物刺激，用含10%胎牛血清的正常RPMI培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2周除去培養(yǎng)基，PBS洗2遍，無水甲醇固定，結(jié)晶紫染色，統(tǒng)計集落形成數(shù)并拍照1.2.5Hoechst33258熒光染色觀察熒光染色觀察取對數(shù)生長期的