社區(qū)兩種耐藥菌的耐藥機制及分子流行病學(xué)研究.pdf

1、目的： 產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases ESBLs)的革蘭氏陰性桿菌感染多在醫(yī)院內(nèi)流行甚至爆發(fā)流行，但近來研究顯示在社區(qū)獲得性感染中分離率日益增高，目前關(guān)于社區(qū)居民中產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌流行狀況知之甚少，本研究旨在調(diào)查社區(qū)老年人腸道攜帶產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的流行情況、相關(guān)危險因素以及ESBLs的基因型，以確定產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌在社區(qū)流行的程度及其特點。 本研究還

2、調(diào)查分析了本地區(qū)青霉素不敏感的肺炎鏈球菌(penicillin nonsusceptible streptococcus pneumoniae PNSP)臨床分離株的青霉素結(jié)合蛋白(PBP)2b、2x及1a的基因變異特點，深入探討其耐藥機制；并采用多位點序列分型(MLST)對PNSP菌株進(jìn)行基因分型以及確定與國際流行株的關(guān)系。上述研究將為控制和預(yù)防本地區(qū)青霉素不敏感肺炎鏈球菌的出現(xiàn)、傳播及進(jìn)化提供有益的線索。 方法： 在

3、鐵西及東陵五個社區(qū)，共調(diào)查了286名社區(qū)老年人，填寫調(diào)查問卷(包括姓名、性別、年齡：慢性疾病史如糖尿病等；過去3個月內(nèi)是否應(yīng)用抗生素；過去3個月內(nèi)是否住院或外科手術(shù))，獲得知情同意后，采集肛拭子標(biāo)本，立即接種于伊紅美蘭選擇性培養(yǎng)基，培養(yǎng)分離鑒定大腸埃希菌，采用Kirby-Bauer藥敏紙片法檢測大腸埃希菌對18種抗生素的敏感性。采用紙片篩選法及雙紙片協(xié)同法篩查產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌。采用脈沖電場凝膠電泳(PFGE)對產(chǎn)ESBLs大腸埃

4、希菌進(jìn)行同源性分析。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析腸道攜帶產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的潛在危險因素。對產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌采用PCR方法擴增ESBLs基因型及測序。 另外收集2006年1月至2007年2月中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院肺炎鏈球菌臨床分離株19株，兒童醫(yī)院肺炎鏈球菌臨床分離株3株，省人民醫(yī)院肺炎鏈球菌臨床分離株2株，共24株，其中21株來自痰標(biāo)本，1株分離自血標(biāo)本，1株分離自膿汁，1株分離自眼分泌物。上述菌株通過奧普托欣

5、紙片及膽汁溶菌實驗進(jìn)行鑒定。采用E-test法檢測肺炎鏈球菌對青霉素及頭孢噻肟的敏感性。選擇18株肺炎鏈球菌(青霉素耐藥株9株，青霉素中介耐藥株5株及青霉素敏感株4株)進(jìn)一步采用PCR方法擴增pbp2x、pbp2b、pbo1a基因及測序分析。另對9株肺炎鏈球菌進(jìn)行MLST分析。 結(jié)果： 1.產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌攜帶率為7.0％。270株大腸埃希菌對亞胺培南及美洛培南均100％敏感，非產(chǎn)ESBLs的菌株對頭孢類抗生素敏

6、感率在96％以上，對氟喹諾酮類藥物敏感率在74％左右。按照臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)的規(guī)定，一旦確定為產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌應(yīng)視為對所有頭孢類抗生素及氨曲南耐藥。19株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌對阿米卡星敏感率94.7％，對阿莫西林/克拉維酸敏感率為63.2％。而且產(chǎn)ESBLs菌常表現(xiàn)出同時對氟喹諾酮類藥物，復(fù)方新諾明，慶大霉素及四環(huán)素耐藥。產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的單因素分析顯示：3個月內(nèi)抗生素暴露史與腸道攜帶產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌

7、密切相關(guān)(OR值3.2，95％可信區(qū)間1.1-9.0 P=0.03)。19株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌進(jìn)行同源性分析，其PFGE圖譜呈多樣性，提示具有不同起源。 2.19株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌均為CTX-M型ESBLs，11株產(chǎn)CTX-M-14型(57.89％)；3株產(chǎn)CTX-M-22型；1株產(chǎn)CTX-M-24型；3株產(chǎn)CTX-M-79型；1株同時產(chǎn)CTX-M-24型及CTX-M-79型(編碼CTX-M-79型基因的核苷酸序列G8

8、65→A堿基替換，導(dǎo)致氨基酸殘基D289→N，故該基因序列出現(xiàn)變異，向GenBank提交該序列，獲得序列號：EF426798)。另外 TEM型陽性率為78.95％，均為TEM-1。19株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌中，8株(42.11％)整合子耐藥基因盒擴增陽性，經(jīng)測序分析，在整合子攜帶了兩個耐藥基因盒：dfr17(二氫葉酸原酶基因-耐甲氧芐啶)以及aadA5(氨基糖苷腺苷轉(zhuǎn)移酶基因)。 3.24株肺炎鏈球菌中，10株(41.67％)

9、為青霉素敏感株(青霉素MIC≤0.06mg/L)，5株(20.83％)為青霉素中介株(青霉素MIC<0.06mg、L及>2mg/L)，9株(37.5％)為青霉素耐藥株(青霉素MIC≥2mg/L)，青霉素MIC50為0.625mg/L，青霉素MIC90為4mg/L，MIC范圍：0.016-4 mg/L。而肺炎鏈球菌對頭孢噻肟的敏感性：以1 mg/L及4mg/L為判斷折點，15株(62.5％)為頭孢噻肟敏感株(頭孢噻肟MIC≤1mg/L)，

10、2株(8.33％)為頭孢噻肟中介株(頭孢噻肟MIC<1mg/L及>4mg/L)，7株(29.17％)為頭孢噻肟耐藥株(頭孢噻肟MIC≥4mg/L)，頭孢噻肟MIC50為0.75mg/L，頭孢噻肟MIC90為4mg/L，MIC范圍：0.032-6mg/L。 4.18株肺炎鏈球菌擴增pbp2x、pbp2b、pbp1a基因并測序后，經(jīng)BioEdit分析及ClustalW比對：首次發(fā)現(xiàn)在菌株sp23的PBP2x氨基酸序列中，緊鄰第一個保

11、守基序STMK出現(xiàn)了Met342→Ile位點的氨基酸替換，伴有青霉素MIC=4mg/L及頭孢噻肟MIC=6mg/L。序列分析提示：大多數(shù)PRSP菌株(青霉素MIC≥1.5mg/L及頭孢噻肟MIC≥2mg/L)具有相同的PBP2b，2x及1a氨基酸序列，而PISP菌株的氨基酸替換則不同于其它國家，表現(xiàn)出本地區(qū)獨特的基因重排。在本研究中出現(xiàn)了基因序列新的變異，已向GenBank提交，獲得序列號：EU035969-EU035971，EU044

12、831，EU056919-EU056922，EU089705-EU089709，EU106881-EU106887，EU124672。 5.對9株肺炎鏈球菌進(jìn)行MLST分析：4株P(guān)RSP菌株(spO2、spO9、sp23及sp24)具有相同的等位基因圖譜(ST320)，為Taiwanl9F-14克隆株(ST236 15-16-19-15-6-20-26)的aroE及ddl位點的雙位點變異體(DLV)；菌株sp18(PRSP)是S

13、pain23F-1克隆株(ST81 4-4-2-4-4-1-1)的recP位點的單位點變異體(SLV)；PISP菌株(spO1)是Taiwanl9F-15克隆株(ST242 15-29-4-21-30-1-14)的recP位點的SLV；sp14與流行株Taiwan19F-14存在spi，xpt及ddl三個位點的差異體(triple-locusvariants TLVs)；在已知MLST數(shù)據(jù)庫中未查到sp15的序列號，提示其為新型。另外s

14、p11為未分型的肺炎鏈球菌株。 結(jié)論： 本項研究提示：在本地區(qū)社區(qū)老年人中，腸道是產(chǎn)ESBLs菌的重要儲菌庫，先前的抗生素暴露史與產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌腸道攜帶密切相關(guān)。我們的研究將為大腸埃希菌所致的內(nèi)源性感染如泌尿系統(tǒng)感染及腹腔內(nèi)感染的抗生素治療策略提供一定的借鑒作用，并且提醒我們有必要制定相關(guān)的政策，采取有效措施，促進(jìn)抗菌藥物合理應(yīng)用，盡可能減少產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的定植。 本研究還發(fā)現(xiàn)本地區(qū)的PRSP的p