重組雞α干擾素-白細胞介素-2融合蛋白體外活性及體內(nèi)最佳使用劑量研究.pdf

1、為了研究重組雞α干擾素/白細胞介素-2融合蛋白（rChIFN-α-Linker-ChIL-2，重組融合蛋白）在雞體外的生物學(xué)活性及在雞體內(nèi)的最佳使用劑量，從而為重組融合蛋白作為抗病毒制劑和免疫增強劑在臨床上推廣應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，本研究采用夾心ELISA方法分別檢測重組融合蛋白與抗rChIFN-α和rChIL-2單抗發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的活性；采用50％細胞病變抑制法進行了重組融合蛋白和rChIFN-α蛋白對照在CEF細胞上抗水泡性口炎病毒

2、（VSV）和傳染性法氏囊病病毒（IBDV）LX強毒株的活性比較研究；采用MTS法進行了重組融合蛋白和rChIFN-α在體外促外周血T淋巴細胞（PBLC）和脾臟淋巴細胞增殖活性實驗。將IBDV LX強毒株人工感染37日齡SPF雞，同時分別選取在CEF細胞上抗VSV活性單位為200IU、1000IU、3000IU、5000IU的重組融合蛋白和rChIFN-α蛋白采用注射方式進行雞體內(nèi)活性比較實驗，以篩選重組融合蛋白和rChIFN-α蛋白在雞

3、體內(nèi)發(fā)揮最佳抗病毒和免疫增強活性的使用劑量；分別通過臨床觀察、檢測攻毒前和攻毒后（dpc）不同時間雞體的排毒率、IBDV在不同組織器官的動態(tài)分布、外周血帶毒時間、外周血中ChIL-2、ChIL-4、ChIL-6、ChIFN-α、ChIFN-γ細胞因子的表達水平，雞PBLC和脾臟淋巴細胞的增殖活性及外周血中淋巴細胞亞群等指標的差異以揭示重組融合蛋白和rChIFN-α蛋白在雞體內(nèi)抗病毒和免疫增強作用的機理，并且篩選重組融合蛋白和rChIFN

4、-α蛋白在雞體內(nèi)發(fā)揮最佳抗病毒活性的最適劑量。采用流式細胞術(shù)檢測14d的SPF雞注射以上實驗篩選出的最佳劑量的重組融合蛋白和rChIFN-α蛋白后不同時間對雞外周血T淋巴細胞亞群含量的影響。
　　結(jié)果：重組融合蛋白可分別與抗rChIFN-α和抗rChIL-2單抗發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，重組融合蛋白中rChIFN-α蛋白和rChIL-2蛋白的相對含量分別為4.58×103pg.mL-1和1.06×103pg.mL-1；重組融合蛋白在CE

5、F細胞上抗VSV和IBDV的活性單位分別為8.707×105IU/mL和5.7926×104IU/mL，rChIFN-α蛋白對照的活性單位分別為2.1469×105IU/mL和1.4482×104IU/mL，兩種蛋白抗VSV活性單位均高于抗IBDV，且重組融合蛋白的抗病毒活性高于rChIFN-α蛋白；重組融合蛋白具有顯著的促PBLC和雞脾臟淋巴細胞的增殖活性，且重組融合蛋白極顯著高于rChIFN-α蛋白對照（p<0.01）。不同劑量的重

6、組融合蛋白在雞體的抗病毒活性存在差異。注射后不同時間，3000IU重組融合蛋白試驗組的IBD典型癥狀持續(xù)時間、病死率、排毒率、各組織器官帶毒率、外周血持續(xù)帶毒率（28h、20％、22.2%、16.7%、23.5%）、血清中抗IBDV抗體水平等指標均顯著低于其他劑量的重組融合蛋白和rChIFN-α蛋白對照，ChIL-2、ChIL-4、ChIL-6、ChIFN-α、ChIFN-γ五種細胞因子的表達水平均顯著高于其他組；12 dpc時，不同實

7、驗組雞的外周血T淋巴細胞、脾臟淋巴細胞增殖活性達到峰值，且3000IU重組融合蛋白實驗組雞的OD490值（0.2654、0.3406）均顯著高于其他實驗組雞（p<0.05）；12 dpc～35 dpc期間，不同劑量的攻毒實驗組雞的CD4+/CD8+比值均顯著低于相同劑量的重組融合蛋白和rChIFN-α蛋白對照組，其中3000IU的重組融合蛋白攻毒組雞的CD4+/CD8+比值顯著高于其他劑量的攻毒實驗組雞和所有rChIFN-α蛋白對照攻毒

8、實驗組；以上各項檢測指標表明，重組融合蛋白的體內(nèi)、外抗病毒和免疫增強活性均高于rChIFN-α蛋白對照，且3000IU的重組融合蛋白在雞體內(nèi)具有最佳的抗病毒和免疫增強活性。重組融合蛋白和rChIFN-α蛋白應(yīng)用SPF雞體后（3 dpi），外周血中CD3+CD4+細胞的含量升高，CD3+CD8+細胞的含量降低，CD4+/CD8+比值大幅升高，且重組融合蛋白實驗組CD4+/CD8+比值顯著高于rChIFN-α蛋白實驗組。
　　結(jié)論：重

9、組融合蛋白可與抗rChIFN-α和抗rChIL-2單抗發(fā)生特異性免疫反應(yīng)；在體外具有顯著的抗VSV和IBDV活性和促外周血T淋巴細胞和脾臟淋巴細胞增殖活性。不同劑量的重組融合蛋白在雞體內(nèi)可通過增強外周血T淋巴細胞和脾臟淋巴細胞增殖活性、提高機體IFN-α和Th1、Th2型細胞因子的表達水平、提高CD4+/CD8+比值等方式增強機體的細胞免疫和體液免疫應(yīng)答水平，發(fā)揮非特異性抗病毒活性和免疫增強活性；3000IU的重組融合蛋白在雞體內(nèi)具有最