Lipocalin2-綠色熒光蛋白融合載體的構(gòu)建及在人腎小管上皮細(xì)胞的定位.pdf

1、目的：構(gòu)建并鑒定Lipocalin2/綠色熒光蛋白融合載體，脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染入人腎近曲小管上皮細(xì)胞，觀察其在人腎近曲小管上皮細(xì)胞中的表達(dá)和定位情況。 方法：根據(jù)基因文庫(kù)(編碼BC033089)報(bào)道的Lipocalin2基因cDNA序列合成引物擴(kuò)增Lipocalin2全編碼區(qū)，并在Lipocalin2全編碼區(qū)兩端分別加上限制性?xún)?nèi)切酶：NSPV和Xho Ⅰ酶切位點(diǎn)。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定為L(zhǎng)ipocalin2基因全編碼區(qū)后，回收、純

2、化Lipocalin2基因。擴(kuò)增真核表達(dá)質(zhì)粒pReceiver-M29(其上有綠色熒光蛋eGFP標(biāo)簽)，用小量質(zhì)粒提取試劑盒提取、純化真核表達(dá)質(zhì)粒pReceiver-M29 DNA。用NSP V和Xho Ⅰ分別酶切Lipocalin2DNA和真核表達(dá)質(zhì)粒pReceiver-M29 DNA，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收、純化產(chǎn)物后，利用T4 DNA連接酶將Lipocalin2連接到真核表達(dá)質(zhì)粒pReceiver-M29中。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大

3、腸桿菌，挑取單個(gè)克隆，提取質(zhì)粒重組質(zhì)粒DNA，限制性?xún)?nèi)切酶NSP V和Xho Ⅰ酶切含有Lipocalin2基因的pReceiver-M29質(zhì)粒，電泳初步鑒定是否構(gòu)建重組質(zhì)粒pReceiver-M29-Lipocalin2成功，進(jìn)一步DNA測(cè)序鑒定是否構(gòu)建重組質(zhì)粒成功。體外復(fù)蘇培養(yǎng)正常人腎近曲小管上皮細(xì)胞株(HK-2)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞0.25％胰蛋白酶消化，2×105/個(gè)接種于共聚焦dish中，待細(xì)胞長(zhǎng)到80％左右融合時(shí)，無(wú)血清164

4、0培養(yǎng)基培養(yǎng)24h同步化，利用脂質(zhì)體(TransFast Transfection Reagent)介導(dǎo)，將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pReceiver-M29-Lipocalin2及空載體pReceiver-M29瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入人腎近曲小管上皮細(xì)胞中，激光共聚焦熒光顯微鏡觀察Lipocalin2基因在人腎近曲小管上皮細(xì)胞中的表達(dá)和定位情況。 結(jié)果： 1、融合表達(dá)載體pReceiver-M29-Lipocalin2構(gòu)建情況：限制性?xún)?nèi)

5、切酶NSP Ⅴ和Xho Ⅰ酶切重組質(zhì)粒及DNA測(cè)序結(jié)果都說(shuō)明所構(gòu)建的重組質(zhì)粒為pReceiver-M29-Lipocalin2融合表達(dá)載體。 2、Lipocalin2基因在人腎近曲小管上皮細(xì)胞中定位情況：瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人腎近曲小管上皮細(xì)胞后激光共聚焦熒光顯微鏡觀察，pReceiver-M29轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和pReceiver-M29-Lipocalin2轉(zhuǎn)染的細(xì)胞熒光布局不同：pReceiver-M29空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞熒光均勻分布在整個(gè)細(xì)

6、胞中，而pReceiver-M29-Lipocalin2融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞熒光主要集中在細(xì)胞漿中。 結(jié)論：成功構(gòu)建pReceiver-M29-Lipocalin2融合表達(dá)載體。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到人腎近曲小管上皮細(xì)胞后，重組載體可在活細(xì)胞中表達(dá)而沒(méi)有細(xì)胞毒性，且具有自發(fā)綠色熒光的特點(diǎn)，可在人腎近曲小管上皮細(xì)胞中觀察Lipocalin2基因的表達(dá)和定位情況，為進(jìn)一步探索Lipocalin2基因在人腎近曲小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和/或逆轉(zhuǎn)分化中