人肝刺激因子綠色熒光蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其亞細(xì)胞定位的初步研究.pdf

1、背景與目的： 肝刺激因子（Hepatic Stimulator Substance,HSS）為從新生動(dòng)物肝臟或從部分肝切除術(shù)后的殘余肝臟中提取的一種活性蛋白。它是一種熱穩(wěn)定蛋白，分子量約為15kD。既往實(shí)驗(yàn)表明，與目前所知的幾種具有肝臟保護(hù)及促肝細(xì)胞再生作用的細(xì)胞因子例如HGF等相比，只有HSS可特異性地刺激肝細(xì)胞或肝源性腫瘤細(xì)胞增殖；并可減輕CCl4、半乳糖胺及雙氧水等藥物對(duì)肝細(xì)胞的損傷；HSS還具有抑制纖維化及抗病毒的作用；

2、此外，肝刺激因子的表達(dá)可增強(qiáng)肝癌細(xì)胞BEL-7402的抗調(diào)亡能力。HSS為何對(duì)肝臟具有特異性的作用，解決這一問題的關(guān)鍵在于如何獲得更多HSS在細(xì)胞內(nèi)的信息。 為此，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了人肝刺激因子 (hHSS)的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白 (Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP)真核表達(dá)載體，導(dǎo)入人肝癌細(xì)胞系BEL-7402中，使hHSS-EGFP融合蛋白表達(dá)，旨在探討hHSS的亞細(xì)胞定位。另外，由于

3、人肝刺激因子的亞細(xì)胞定位信號(hào)未知，所以我們構(gòu)建了pEGFP-C1-hHSS和pEGFP-N1-hHSS兩種重組質(zhì)粒，通過比較N端與C端這兩種載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后的不同效應(yīng)，粗略推測(cè)hHSS亞細(xì)胞定位的信息所在。 方法： 合成帶有不同酶切位點(diǎn)的引物，運(yùn)用PCR方法，從質(zhì)粒pUC18-hHSS中擴(kuò)增出人肝刺激因子基因開放閱讀框序列，作為目的片段，用T-A克隆方法連至pMD18-T載體，再分別定向克隆至pEGFP-C1和pEGFP-

4、N1兩種真核綠色熒光蛋白表達(dá)載體，獲得兩種重組質(zhì)粒pEGFP-C1-hHSS和pEGFP-N1-hHSS。將兩種重組質(zhì)粒用不同的限制性內(nèi)切酶酶切并進(jìn)行測(cè)序鑒定，再將重組的兩種質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染人肝癌BEL-7402細(xì)胞，用激光共聚焦顯微鏡觀察其定位，比較兩種載體的不同效應(yīng)，并初步確定hHSS的亞細(xì)胞定位及hHSS定位信號(hào)所在位置。 結(jié)果： 1．測(cè)序結(jié)果顯示兩種重組載體中的hHSS序列正確，開放閱讀框無移碼突變。

5、 2．轉(zhuǎn)染了pEGFP-N1-hHSS細(xì)胞中表達(dá)的綠色熒光蛋白，于轉(zhuǎn)染24h后呈彌散狀態(tài)，在胞漿和胞核都有分布；48h后主要聚集于胞漿中，核周的胞漿中可見粗顆粒狀熒光物質(zhì)的聚集，可能為高爾基體，胞漿和核的界線明顯，胞核亦可見少量的綠色熒光蛋白；72h后在胞漿內(nèi)呈斑點(diǎn)狀散在分布，胞漿內(nèi)的部分與復(fù)染的紅色熒光(代表線粒體)重疊成黃色；96h后清晰聚集于胞漿內(nèi)，在胞核周圍呈散在分布，與復(fù)染的紅色熒光重疊成黃色。 3．轉(zhuǎn)染了pEGFP-

6、C1-hHSS細(xì)胞中表達(dá)的綠色熒光蛋白，未見明顯的動(dòng)態(tài)變化過程。于轉(zhuǎn)染后混合分布于細(xì)胞內(nèi)，以粗顆粒熒光為主，胞漿、核及細(xì)胞膜的界限不明顯，胞漿中可見未染色的圓形空洞，與復(fù)染的紅色熒光（代表線粒體）和藍(lán)色熒光（代表胞核）都有重疊。轉(zhuǎn)染后96h，可觀察到綠色熒光在胞漿內(nèi)的聚集，但其與紅色熒光并不完全重疊。 結(jié)論： 1．成功構(gòu)建了hHSS的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的重組真核表達(dá)載體。 2．重組質(zhì)粒pEGFP-C1-hHSS與