西羅莫司抑制腎移植后AGEs誘導動脈粥樣硬化形成的作用及其機制.pdf

1、目的：探討晚期糖基化終末產物(AGEs)誘導VSMCs向成骨樣細胞表型轉分化的相關分子機制及腎移植術后西羅莫司對AGEs誘導的VSMCs向成骨樣細胞表型轉分化的作用及相關分子機制。
　　方法：體外分離和培養(yǎng)原代SD大鼠胸主動脈平滑肌細胞(VSMCs)，進行細胞傳代至第4～6代，采用光學顯微鏡觀察細胞形態(tài)及間接免疫熒光染色法測定α-平滑肌肌動蛋白(αSMA)表達以鑒定細胞是否具有VSMCs特性。取第5代SD大鼠胸主動脈VSMCs為體

2、外實驗對象，用200 mg/L的AGEs或BSA分別作用VSMCs細胞不同時間(0h～12d);此外，部分細胞以2.0ug的pcDNA3.1或整合素鏈激酶(ILK)質粒轉染24h，或以抗AGE受體(RAGE)抗體預處理12h后，再予200 mg/L的AGEs或BSA處理9d，收集細胞，用蛋白質印跡法檢測SD大鼠胸主動脈VSMCs上α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、骨橋蛋白(OPN)、ILK的表達變化，并以甲-酚酞絡合酮方法檢測該細胞中鈣

3、離子濃度的變化。同樣進行體外分離和培養(yǎng)SD大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞(VSMCs)，以第5代大鼠主動脈VSMCs為體外實驗對象，根據處理方式的不同將細胞分為:西羅莫司組（西羅莫司處理）、AGEs組（AGEs處理）、西羅莫司+AGEs組（西羅莫司和AGEs共處理）及對照組（溶劑處理）。SD大鼠胸主動脈VSMCs經10nm西羅莫司和或200mg/L AGEs處理9d后，收集細胞s，采用蛋白質印跡法檢測VSMCs中α-SMA、OPN、堿性磷酸

4、酶(ALP)、增殖細胞核抗原(PCNA)和整合素鏈激酶(ILK)的表達;并以甲酚酞絡合酮方法檢測細胞鈣離子濃度。
　　結果：光學顯微鏡下顯示第4～6代SD大鼠胸主動脈VSMCs的細胞形態(tài)與原代細胞無明顯差別;間接免疫熒光染色結果也顯示其α-SMA的表達強度與原代細胞相似。體外實驗結果表明:AGEs作用后SD大鼠胸主動脈VSMCs中α-SMA的表達呈時間依賴性減少;同時，OPN表達呈時間依賴性增加;且鈣離子濃度也具有AGEs濃度依賴

5、性增加趨勢(P＜0.05)。此外，與對照組相比，以AGEs處理SD大鼠胸主動脈VSMCs6h后，該細胞中ILK的表達顯著增加，在12h達高峰，24h始開始下降(P＜0.05);與轉染空白質粒載體(pcDNA3.1)的SD大鼠胸主動脈VSMCs相比，以野生型ILK質粒轉染細胞上調ILK表達后，可使該細胞中α-SMA的表達明顯下降;而OPN表達則顯著增加，進一步以AGEs作用此類細胞后，則使α-SMA表達進一步降低，OPN表達進一步增加。而

6、以抗RAGE中和抗體預處理細胞后，可抑制AGEs誘導的ILK表達增加（P＜0.05）。我們實驗還顯示AGEs可抑制SD大鼠胸主動脈VSMCs中α-SMA表達;誘導OPN、PCNA和ILK的表達上調、并使細胞中ALP表達及鈣離子濃度明顯增加(P＜0.05);而與AGEs組相比，西羅莫司預處理細胞后則可抑制AGEs介導的上述效應（P＜0.05）。
　　結論：AGEs可能通過與其受體----RAGE結合后激活ILK相關細胞內信號通路進而