膠質(zhì)瘤干細(xì)胞（GSCs）的分離與鑒定及GSCs基因組甲基化狀態(tài)的測(cè)定.pdf

1、隨著干細(xì)胞研究領(lǐng)域的飛速發(fā)展和實(shí)驗(yàn)技術(shù)的進(jìn)步，“腫瘤干細(xì)胞學(xué)說”再次受到人們的關(guān)注。目前已陸續(xù)在白血病、乳腺癌、腦腫瘤、結(jié)腸癌、肝癌和前列腺癌中得到證實(shí)，并被越來越多的學(xué)者所接受，并認(rèn)為，是腫瘤發(fā)生起源、演進(jìn)、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的根源。由于腫瘤干細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞中所占比例很低，且培養(yǎng)條件苛刻，如何建立穩(wěn)定的腫瘤干細(xì)胞分離培養(yǎng)平臺(tái)是該研究領(lǐng)域必須解決的關(guān)鍵問題。 腫瘤干細(xì)胞相繼在多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等神經(jīng)上皮源性腫瘤中得到證實(shí)，多篇報(bào)道膠質(zhì)瘤

2、干細(xì)胞(gliomastemcell，GSCs)的存在。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中，少突膠質(zhì)細(xì)胞源性腫瘤的發(fā)病率僅次于星形細(xì)胞腫瘤。間變性少突-星形細(xì)胞瘤具有明顯的生長(zhǎng)侵襲性，對(duì)人體危害很大。目前尚缺乏少突-星形細(xì)胞瘤中GSCs的研究報(bào)道。 胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞的分化主要受控于其表觀遺傳學(xué)機(jī)制，基因組甲基化是表觀遺傳學(xué)機(jī)制的重要組成部分。腫瘤干細(xì)胞表觀遺傳學(xué)機(jī)制，特別DNA甲基化狀態(tài)尚未見報(bào)道。闡明腫瘤干細(xì)胞表觀遺傳學(xué)機(jī)制在腫瘤誘導(dǎo)

3、分化治療中具有重要意義。 本研究運(yùn)用組織塊干涸培養(yǎng)法培養(yǎng)人間變性少突-星形細(xì)胞瘤腫瘤細(xì)胞，在此基礎(chǔ)上利用條件培養(yǎng)基壓力篩選和單克隆培養(yǎng)法從腫瘤細(xì)胞中分離培養(yǎng)出GSCs，并運(yùn)用免疫熒光染色和克隆形成對(duì)其進(jìn)行了鑒定。此外，利用皮下注射GSCs進(jìn)行體內(nèi)腫瘤實(shí)驗(yàn)。此外，利用RT-PCR檢測(cè)了人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87中GSCs和貼壁腫瘤細(xì)胞中DNMT1的mRNA水平，分別采用Westernblot和免疫熒光染色檢測(cè)了DNMT1蛋白表達(dá)水平

4、，運(yùn)用高效液相色譜檢測(cè)了GSCs和貼壁腫瘤細(xì)胞的基因組甲基化水平。主要結(jié)果和結(jié)論如下： 1.人間變性少突-星形細(xì)胞瘤中表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物的腫瘤細(xì)胞和GSCs的分離培養(yǎng) (1)免疫熒光染色顯示，腫瘤組織中散在分布著共表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物CD133和Nestin的腫瘤細(xì)胞。 (2)運(yùn)用組織塊干涸培養(yǎng)法從人間變性少突星形細(xì)胞瘤中培養(yǎng)出原代腫瘤細(xì)胞，這一步相對(duì)簡(jiǎn)單，容易操作。獲得了一些干涸培養(yǎng)的體會(huì)，包括在放入組織塊之前要

5、用胎牛血清預(yù)潤(rùn)培養(yǎng)瓶底，培養(yǎng)瓶中細(xì)胞塊的大小應(yīng)在1mm3以下，鋪展的間距應(yīng)大于5mm，倒置時(shí)間應(yīng)該在3至4小時(shí)之間。 (3)利用條件培養(yǎng)基壓力篩選和單克隆培養(yǎng)法從腫瘤細(xì)胞中分離培養(yǎng)出具有干細(xì)胞特性的腫瘤細(xì)胞，即GSCs。在干細(xì)胞完全培養(yǎng)基中，分化的腫瘤細(xì)胞貼壁并且生長(zhǎng)受到抑制，而GSCs能夠在培養(yǎng)基中呈克隆球樣懸浮生長(zhǎng)。傳代后，適當(dāng)比例接種培養(yǎng)，單細(xì)胞可逐漸形成較多的細(xì)胞球，形態(tài)同前一代細(xì)胞球相似。 2.GSCs的鑒定

6、 免疫熒光染色顯示干細(xì)胞完全培養(yǎng)基中懸浮生長(zhǎng)的克隆球表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物CD133和Nestin。將其重新接種于含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基后，克隆球可以貼壁分化，免疫熒光染色顯示分化的細(xì)胞部分表達(dá)GFAP，部分表達(dá)MBP，兩種均為少突-星形細(xì)胞腫瘤中的分化標(biāo)志物，具有多向分化能力。雙標(biāo)染色顯示，大部分分化細(xì)胞在分化標(biāo)志物的表達(dá)上沒有重疊，少部分分化細(xì)胞有GFAP和MBP的共表達(dá)。 有限稀釋法結(jié)果顯示，原代腫瘤

7、細(xì)胞中，具有自我更新能力并且能夠呈克隆球樣生長(zhǎng)的細(xì)胞比例約為2.49％±0.13％，而克隆球中有36.54％±1.41％的細(xì)胞具有自我更新能力，能夠進(jìn)行對(duì)稱分裂，使干細(xì)胞在條件培養(yǎng)基中增殖。 3.人間變性少突-星形細(xì)胞瘤GSCs體內(nèi)研究模型的建立 (1)與貼壁分化的腫瘤細(xì)胞相比，GSCs具有更強(qiáng)的致瘤能力。接種10周后，接種干細(xì)胞完全培養(yǎng)基中的貼壁細(xì)胞的SCID小鼠皮下均未見移植瘤長(zhǎng)出，而接種GSCs的SCID小鼠右腋下

8、均見移植瘤長(zhǎng)出，5×103細(xì)胞量接種組移植瘤體積為0.38±0.08cm3，5x104細(xì)胞量接種組移植瘤體積為0.64±0.02cm3，兩組間存在顯著性差異。 (2)人少突-星形細(xì)胞瘤中干細(xì)胞樣的腫瘤細(xì)胞可以在小鼠體內(nèi)重建原發(fā)瘤的分化表型。結(jié)果顯示，移植瘤中可以檢測(cè)到CD133以及Nestin陽(yáng)性細(xì)胞呈巢狀分布，與患者原發(fā)瘤相比，移植瘤中具有干細(xì)胞樣表型的腫瘤細(xì)胞比例明顯升高。移植瘤組織中還有散在分布著GFAP陽(yáng)性細(xì)胞和MBP陽(yáng)

9、性細(xì)胞。 4.利用RT-PCR檢測(cè)了人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87中膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和貼壁腫瘤細(xì)胞中DNMT1的mRNA水平，利用Westernblot和免疫熒光染色檢測(cè)了DNMT1蛋白表達(dá)水平，運(yùn)用高效液相色譜檢測(cè)了人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87中膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和貼壁腫瘤細(xì)胞的全基因組甲基化水平。 與貼壁腫瘤細(xì)胞相比，腫瘤干細(xì)胞DNMT1的mRNA水平?jīng)]有差別，但DNMT1 蛋白表達(dá)明顯升高。人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87中膠質(zhì)瘤干細(xì)

10、胞和貼壁腫瘤細(xì)胞全基因組甲基化水平?jīng)]有差別。 綜上所述，人間變性少突-星形細(xì)胞瘤組織中存在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞。這些細(xì)胞在腫瘤組織中所占比例很低，表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物CD133和Nestin，在干細(xì)胞完全培養(yǎng)基中呈克隆球樣懸浮生長(zhǎng)，具有自我更新和多向分化能力,與貼壁分化的腫瘤細(xì)胞相比，有更強(qiáng)的成瘤能力。人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87中GSCs和貼壁腫瘤細(xì)胞全基因組甲基化水平未見明顯差別，但DNMT1的蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。結(jié)果提示，抑制DNMT1