黑色素瘤全基因組DNA甲基化與組蛋白甲基化異常譜式的研究.pdf

1、第一部分、黑色素瘤細(xì)胞全基因組DNA甲基化譜的改變及其特征
　　 目的：研究黑色素瘤全基因組DNA甲基化譜的改變及其特征。
　　 方法：抽提黑色素瘤細(xì)胞系SK-MEL-28、LOXIMVI和正常黑素細(xì)胞HEMn及HEMa的基因組DNA，用限制性內(nèi)切酶SmaI和XmaI依次充分消化，然后對(duì)得到的DNA片段進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，利用第二代測(cè)序技術(shù)獲得文庫(kù)中DNA片段的末端序列信息，通過(guò)計(jì)算出每一個(gè)CpG位點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的SmaI和XmaI

2、切割末端的數(shù)量比，從而反映出該CpG位點(diǎn)的甲基化程度。這一方法稱為“基于限制性內(nèi)切酶原理的DNA甲基化數(shù)字化分析(DREAM)”。通過(guò)與正常黑素細(xì)胞比較，分析黑色素瘤細(xì)胞DNA甲基化譜的改變及其特點(diǎn)。
　　 結(jié)果：黑色素瘤中啟動(dòng)子區(qū)域以外存在大量非CpG島位點(diǎn)的異常低甲基化，而全基因組范圍內(nèi)存在部分CpG島的異常高甲基化。黑色素瘤基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島的甲基化狀態(tài)與基因表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(在SK-MEL-28和LOXIMVI中的S

3、pearman相關(guān)系數(shù)分別為-0.39、-0.57，p值均小于0.001)。正常黑素細(xì)胞中啟動(dòng)子CpG島處于甲基化狀態(tài)的基因比處于非甲基化的基因更傾向于在黑色素瘤中發(fā)生異常高甲基化(p<0.001)。
　　 結(jié)論：黑色素瘤基因組存在整體性低甲基化和廣泛的CpG島高甲基化改變。正常黑素細(xì)胞中啟動(dòng)子CpG島的甲基化狀態(tài)決定其在黑色素瘤中發(fā)生異常高甲基化的傾向。
　　 第二部分、黑色素瘤細(xì)胞全基因組組蛋白甲基化譜式的異常及其特

4、征
　　 目的：研究黑色素瘤全基因組范圍組蛋白H3K4me3和H3K27me3譜式的改變及其特征。
　　 方法：以黑色素瘤細(xì)胞系SK-MEL-28、LOXIMVI和正常黑素細(xì)胞HEMn及HEMa為研究對(duì)象，采用針對(duì)H3K4me3和H3K27me3的特異性抗體進(jìn)行染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序(ChIP-seq)實(shí)驗(yàn)，以抗H3抗體作為對(duì)照。用所得高通量數(shù)據(jù)對(duì)黑色素瘤細(xì)胞系與正常黑素細(xì)胞的H3K4me3/H3K27me3修飾譜進(jìn)行分析

5、比較。
　　 結(jié)果：H3K4me3和H3K27me3在全基因組的分布及其對(duì)基因表達(dá)的影響不同。H3K4me3主要集中在基因啟動(dòng)子區(qū)域，與基因的活性表達(dá)相關(guān)(p<0.001)，而H3K27me3傾向于覆蓋整個(gè)基因，與基因表達(dá)抑制相關(guān)(p<0.001)。正常黑素細(xì)胞中具有H3K4me3和H3K27me3標(biāo)記的二價(jià)修飾基因，約90％在黑色素瘤中存在H3K4me3或H3K27me3標(biāo)記的缺失；而H3K27me3單獨(dú)標(biāo)記的基因約70％在黑

6、色素瘤中發(fā)生H3K27me3標(biāo)記的缺失。相反地，正常黑素細(xì)胞中H3K4me3單獨(dú)標(biāo)記的基因約70％在黑色素瘤中仍維持H3K4me3單獨(dú)標(biāo)記狀態(tài)，僅30％或更少的比例發(fā)生H3K4me3標(biāo)記的缺失。
　　 結(jié)論：黑色素瘤存在全基因組范圍H3K4me3和H3K27me3修飾譜的顯著改變。
　　 第三部分、黑色素瘤DNA甲基化與組蛋白甲基化修飾狀態(tài)的關(guān)系
　　 目的：研究黑色素瘤DNA甲基化與組蛋白H3K4me3和H3K

7、27me3的關(guān)系。
　　 方法：以黑色素瘤細(xì)胞系SK-MEL-28、LOXIMVI和正常黑素細(xì)胞HEMn及HEMa為研究對(duì)象，對(duì)全基因組范圍DNA甲基化譜與組蛋白H3K4me3和H3K27me3修飾譜的數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)與分析。
　　 結(jié)果：在同一細(xì)胞中，啟動(dòng)子區(qū)域CpG島處于非甲基化時(shí)比處于甲基化狀態(tài)時(shí)結(jié)合H3K4me3的比例更高(p<0.001)。正常黑素細(xì)胞中具有H3K4me3組蛋白標(biāo)記的基因在黑色素瘤中發(fā)生啟動(dòng)子區(qū)域C