豬圓環(huán)病毒病-乙型腦炎-細小病毒病三聯(lián)滅活疫苗的研制及其在試驗動物模型上的免疫原性評價.pdf

1、豬圓環(huán)病毒病、豬乙型腦炎和豬細小病毒病均能引起豬的繁殖障礙，且目前多表現為混合感染或繼發(fā)感染，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經濟損失。疫苗免疫接種是防控這三種傳染病的主要和有效措施，但市場上僅有商品化單苗。隨著規(guī)?；B(yǎng)殖的發(fā)展，豬場免疫接種工作量的加大，使用單苗進行免疫費時、費力，而且對動物造成很大應激，影響免疫效果。因此，現代規(guī)模化養(yǎng)殖生產中，迫切需要能夠簡化免疫程序，一針多防的聯(lián)苗。本研究以研制豬圓環(huán)病毒病-乙型腦炎-細小病毒病三聯(lián)滅活疫苗為

2、目標，完成了以下研究工作:
　　一.建立了基于PCV2 Cap蛋白的間接ELISA方法。用PCR方法獲得截短的豬圓環(huán)病毒2型orf2基因，經酶切后克隆至原核表達載體pET28a后，在終濃度為40μMIPTG，30℃下誘導表達3h后，經SDS-PAGE分析，目的基因得到正確表達，大小約為24 KDa左右，表達產物以可溶性表達為主;Western bloting檢測證實其具有免疫反應活性。以純化的Cap蛋白為包被抗原，建立了檢測PCV

3、2抗體的間接ELISA方法。建立的ELISA方法的最佳反應條件是:抗原最適包被量為2μg/孔，包被時間為37℃包被1h后4℃過夜;血清工作濃度為1∶200，作用時間為1h;二抗選用HRP標記的兔抗豬IgG，稀釋度為1∶2000，作用時間為1h;顯色液TMB作用時間為15 min;判定標準為，樣品OD450值大于或等于0.211判定為陽性，小于0.211判定為陰性。所建ELISA方法具有良好特異性，重復性和準確性。對120份疑似豬PCV2

4、血清樣品進行檢測，結果顯示，該方法與PCV2商品化試劑盒檢測結果有較高的符合率。本研究所建立間接ELISA方法可用于PCV2抗體檢測和流行病學調查。
　　二.制備了豬圓環(huán)病毒病-乙型腦炎-細小病毒病三聯(lián)滅活疫苗并在試驗動物模型上對其免疫原性進行研究。利用分離鑒定的豬圓環(huán)病毒2型XX株、豬乙型腦炎病毒XX株與豬細小病毒XX株，制備三聯(lián)滅活疫苗及相應的單苗和二聯(lián)苗。對制備的疫苗進行物理性狀、無菌檢驗和安全檢驗后，免疫昆明鼠和BALB/

5、c小鼠，進行抗體持續(xù)期試驗，肌內免疫和皮下免疫的免疫效果對比試驗以及攻毒保護試驗;免疫豚鼠，進行免疫原性試驗及肌內免疫和皮下免疫的免疫效果對比試驗。結果顯示:試制三聯(lián)滅活苗在免疫昆明鼠后，誘導的乙型腦炎病毒抗體在首免后八周達到高峰，峰值要優(yōu)于相應單苗、二聯(lián)苗和商品苗;三聯(lián)苗免疫BALB/c小鼠后，誘導產生的PCV2抗體在首免后六周達到高峰，且抗體水平要高于相應單苗;三聯(lián)苗免疫豚鼠后，誘導產生的豬細小病毒抗體在首免后四周已具有保護力，在首