農(nóng)桿菌介導(dǎo)rd29A啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)AVP1基因轉(zhuǎn)化匍匐翦股穎的研究.pdf

1、隨著我國(guó)草坪業(yè)的快速發(fā)展，草坪草遺傳育種工作越來(lái)越受到人們關(guān)注，生物技術(shù)在草坪草品種改良中具有很大的應(yīng)用潛力。干旱和高鹽是限制草坪草生長(zhǎng)的主要環(huán)境因子，當(dāng)前我國(guó)特別缺乏抗旱耐鹽的草坪草品種。利用植物基因工程技術(shù)，克隆并轉(zhuǎn)化抗旱耐鹽基因，使其在草坪草中表達(dá)，可以明顯加快耐鹽抗旱新品種的選育，具有廣闊的應(yīng)用前景。 擬南芥液泡質(zhì)子焦磷酸酶Arabidopsis Vacuolar H<'+>-Pyrophosphatase(AVP1)通

2、過(guò)調(diào)節(jié)液泡膜兩側(cè)的質(zhì)子梯度，控制植物生長(zhǎng)激素的運(yùn)輸，隨之影響依賴生長(zhǎng)素的各種發(fā)育事件，使植物在高鹽和干旱脅迫下產(chǎn)生適應(yīng)性。擬南芥rd29A(Resoonsiveto Dehydration，rd29A)啟動(dòng)子是脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，能在干旱、低溫和高鹽條件驅(qū)動(dòng)下游基因表達(dá)。本文運(yùn)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將從擬南芥中克隆的AVP1基因轉(zhuǎn)入匍匐翦股穎，在誘導(dǎo)型的rd29A啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下進(jìn)行表達(dá)，并對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因匍匐翦股穎進(jìn)行抗旱耐鹽生理測(cè)定，獲得了抗旱耐鹽

3、性增強(qiáng)的草坪草。 主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1、建立了草坪草的愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)。以冷季型草坪草匍匐翦股穎和高羊茅的種子作為外植體，愈傷組織誘導(dǎo)率分別為53.0±8.7％和60.7±7.9％，均能誘導(dǎo)產(chǎn)生胚性愈傷組織，胚性愈傷組織生長(zhǎng)穩(wěn)定，繼代一個(gè)月后生長(zhǎng)速率可達(dá)206.0±43.7％和159.3±34.4％。而暖季型草坪草狗牙根以種子作為外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率僅為14.7±4.0％，且只產(chǎn)生非胚性愈傷組織，該愈傷組織生

4、長(zhǎng)速率為78.4±23.2％；以狗牙根的節(jié)作為外植體可以誘導(dǎo)出胚性愈傷組織，但數(shù)次繼代后轉(zhuǎn)為非胚性愈傷組織。 2、通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將rd29A啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)AVP1基因的pCambia1302表達(dá)載體轉(zhuǎn)入匍匐翦股穎。分別用濃度為50、75、100mg/L潮霉素篩選轉(zhuǎn)化愈傷組織，三種濃度的篩選率為64.1±5.0％、81.5±1.5％和33.3±3.8％。經(jīng)過(guò)一個(gè)半月的篩選，50mg/L潮霉素篩選后的轉(zhuǎn)化愈傷的hpt-PCR陽(yáng)性植株比

5、率僅為0.9％，75mg/L濃度下的分化植株hpt-PCR陽(yáng)性比率高達(dá)96.7％。因此，確定75mg/L為匍匐翦股穎轉(zhuǎn)化愈傷的最佳篩選濃度。 3、轉(zhuǎn)基因匍匐翦股穎植株的PCR鑒定。獲得再生匍匐翦股穎植株90株，其中hpt-PCR陽(yáng)性株87株，陽(yáng)性比率為96.7％；AVP1-PCR.陽(yáng)性株13株，陽(yáng)性比率為14.4％。 4、轉(zhuǎn)基因匍匐翦股穎愈傷組織中AVP1基因表達(dá)的RT-PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，在正常培養(yǎng)條件下轉(zhuǎn)基因愈傷A

6、VP1基因微量表達(dá)，而在干旱(干燥48h)、低溫(4℃，24h)或高鹽(200mM NaCl)脅迫下AVP1基因的表達(dá)均明顯增強(qiáng)；未轉(zhuǎn)基因的野生型材料中，無(wú)論處理與否均未檢測(cè)到AVP1基因的表達(dá)。該結(jié)果表明在非脅迫條件下rd29A啟動(dòng)子的活性很低，而在干旱、低溫或高鹽處理?xiàng)l件下活性明顯增強(qiáng)，從而啟動(dòng)其下游基因AVP1的表達(dá)。由此驗(yàn)證了干旱、低溫和高鹽條件能促進(jìn)轉(zhuǎn)基因匍匐翦股穎中目的基因AVP1的表達(dá)水平。 5、轉(zhuǎn)基因匍匐翦股穎愈

7、傷組織的抗性生理分析。經(jīng)干燥處理2天和3天后，轉(zhuǎn)基因愈傷組織的恢復(fù)生長(zhǎng)速率為645％和543％，野生型的為423％和135％，可見(jiàn)轉(zhuǎn)基因匍匐翦股穎比野生型具有更強(qiáng)的耐旱性；在高鹽脅迫下，用0-200 mM不同濃度NaCl處理的轉(zhuǎn)基因愈傷，其生長(zhǎng)速率均高于相同情況下的野生型愈傷。尤其是在NaCI濃度分別為50mmol/L，200mmol/L時(shí)兩者的差異較大，分別相差170％和148％。表明轉(zhuǎn)AVP1基因的匍匐翦股穎的高鹽耐受性增強(qiáng)。

8、 6、轉(zhuǎn)基因匍匐翦股穎植株的抗性生理分析。經(jīng)過(guò)9天的干旱脅迫后，轉(zhuǎn)基因翦股穎小苗葉片為鮮綠色，而野生型草葉片則明顯萎焉變黃。對(duì)干旱處理前后小苗相對(duì)含水量進(jìn)行測(cè)定，干旱處理前轉(zhuǎn)基因和野生型翦股穎小苗的含水量差異不明顯，而干旱脅迫后轉(zhuǎn)基因翦股穎的含水量為82.6％，明顯高于野生型的77.5％，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因匍匐翦股穎比野生型耐旱。轉(zhuǎn)基因植株根的生物量測(cè)定結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株根的干重平均為0.17±0.02g，而野生型植株平均只有0.07±0.