rd29A低溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的AcInV基因反義植物表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì)馬鈴薯的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、本研究從馬鈴薯塊莖中克隆到與馬鈴薯塊莖低溫糖化代謝過程密切相關(guān)的關(guān)鍵酶-酸性轉(zhuǎn)化酶(AcInV)基因,并從擬南芥菜葉片中克隆到rd29A基因低溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子,亞克隆了綠色熒光蛋白(GFP)基因.測(cè)序結(jié)果表明,酸性轉(zhuǎn)化酶基因長度為1.92kb,與GenBank中已注冊(cè)的序列(序列號(hào):AY037937)同源性為98.8﹪.由于本研究中采用的是反義基因技術(shù),個(gè)別堿基的突變并不影響該基因在反義RNA中的功能;rd29A啟動(dòng)子片段與GenBank

2、中已注冊(cè)的序列(序列號(hào):D13044)同源性為99.47﹪,雖有少數(shù)堿基的突變,但突變均未發(fā)生在啟動(dòng)子序列的關(guān)鍵調(diào)控活性位點(diǎn),對(duì)其活性不會(huì)產(chǎn)生任何影響;而亞克隆的GFP基因的堿基序列未發(fā)生任何突變.本文對(duì)來自擬南芥(Arabidopsis thaliana)rd29A啟動(dòng)子的活性進(jìn)行了研究.序列分析表明該啟動(dòng)子具有兩個(gè)干旱、高鹽和低溫響應(yīng)順式作用元件(DRE),TATA box存在于-851~-856bp處,其它主要調(diào)控區(qū)域也存在.通過

3、基因槍法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮瞬時(shí)表達(dá)GFP基因.結(jié)果表明,在0℃均未觀察到GFP的表達(dá);在28℃、25℃、10℃、4℃條件下,rd29A啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GFP基因在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中均有表達(dá),而對(duì)照在4℃并未表達(dá);在10℃與28℃條件下,GFP基因的表達(dá)比對(duì)照強(qiáng),說明rd29A啟動(dòng)子既是低溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子,又是干旱脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子,可滿足在低溫/干旱條件下使目的基因在轉(zhuǎn)基因植物中進(jìn)行表達(dá)的目的.利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)馬鈴薯的遺傳轉(zhuǎn)化研究,初步建立了馬鈴薯莖段和葉

4、盤兩種外植體的再生體系,莖段愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:1/2MS+2.5 mg/L6-BA+0.5 mg/L2,4-D,芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基:1/2MS+2.5mg/L6-BA+5mg/LGA<,3>,葉盤愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基中加入6-BA、2,4-D的濃度高于莖段愈傷誘導(dǎo);其芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基與莖段誘導(dǎo)培養(yǎng)基一致.通過外植體Kan敏感性試驗(yàn),確定了篩選時(shí)Kan的使用濃度:莖段為70mg/L、葉盤為25 mg/L為宜.并對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了優(yōu)化:采用加入Ag

5、NO<,3>有效的防止了外植體在培養(yǎng)過程中的褐化問題;轉(zhuǎn)化過程中莖段預(yù)培養(yǎng)2天、葉盤預(yù)培養(yǎng)3天、共培養(yǎng)時(shí)間莖段為3天、葉盤以2天為宜.對(duì)農(nóng)桿菌浸染時(shí)間和浸染濃度進(jìn)行了試驗(yàn),得出農(nóng)桿菌濃度(OD<,600>)為0.5~0.8,感染時(shí)間為5min,愈傷的長勢(shì)最強(qiáng),轉(zhuǎn)化效率最為理想.對(duì)于抗性篩選過程的污染采用加入Cb(300mg/L),有效的抑制了培養(yǎng)過程中的污染問題.從兩種受體的愈傷誘導(dǎo)和芽分化來看,莖段具有愈傷誘導(dǎo)率高,分化再生能力強(qiáng),褐