血紅素氧化酶-1(HO-1)在實驗性糖尿病中的作用及其啟動子基因多態(tài)性與2型糖尿病(T2DM)易感性的關(guān)聯(lián)研究.pdf

1、關(guān)于HO-1與DM關(guān)系的研究目前主要集中于體外試驗，DM動物模型體內(nèi)HO-1的作用研究較少，且結(jié)果不太一致；而關(guān)于HO-1是否對DM病人具有同樣效應(yīng)的流行病學(xué)研究剛剛開展，值得進一步探討。此外，疾病關(guān)聯(lián)的遺傳研究發(fā)現(xiàn)，遺傳可變性能夠影響HO-1對外源性應(yīng)激的反應(yīng)，個體處于應(yīng)激時HO-1反應(yīng)有很大差異。已有研究報道HO-1基因啟動子區(qū)域有兩處潛在的功能性多態(tài)性位點：(GT)n微衛(wèi)星多態(tài)性和T(-413)A SNP位點，對應(yīng)激因素誘導(dǎo)的HO

2、-1反應(yīng)具有調(diào)節(jié)作用。因此，深入研究個體的HO-1基因型與T2DM發(fā)生的關(guān)聯(lián)可以為其臨床應(yīng)用的可行性提供理論指導(dǎo)。 因此，本研究擬從動物試驗和流行病學(xué)研究角度開展，分別探討某天然抗氧化劑對DM小鼠腎臟氧化應(yīng)激通路的作用及HO-1介導(dǎo)的機制研究，以及HO-1啟動子基因多態(tài)性與T2DM易感性的關(guān)聯(lián)研究。 第一部分、動物試驗 目的：觀察不同病程的DM（4 w和8 w）小鼠腎臟氧化應(yīng)激和HO-1系統(tǒng)的動態(tài)變化，探討HO-

3、1在（diabetic nephropathy，DN）發(fā)展進程中的作用；同時，觀察某天然抗氧化劑（MG）的保護作用機制，對HO-1在抗氧化劑篩選中的作用進一步闡明。 方法：雄性Balb/c小鼠采用四氧嘧啶誘導(dǎo)DM模型。正常小鼠及DM小鼠分別按治療方式的不同進一步分為3個亞組：對照組：生理鹽水灌胃；低劑量MG組：150 mg/kg MG灌胃；高劑量MG組：300 mg/kg MG灌胃。灌胃4 w、8 w后分別檢測血糖、果糖胺、脂類

4、和腎功能指標；腎臟線粒體氧化損傷和抗氧化系統(tǒng)指標：丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、錳超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase，Mn-SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）以及腎臟微粒體HO-1活性；腎臟HO-1和Mn-SOD mRNA的表達水平；并進

5、行腎臟病理學(xué)檢查。 結(jié)果： （1）MG對DM小鼠一般狀況的影響 （2）MG對DM小鼠血糖、果糖胺和血脂的影響 （3）MG對DM小鼠腎臟結(jié)構(gòu)和功能的影響 （4）MG對DM小鼠腎臟線粒體氧化損傷和抗氧化系統(tǒng)的影響 （5）MG對DM小鼠腎臟微粒體HO-1活性的影響 （6）MG對DM實驗小鼠腎臟HO-1和Mn-SOD mRNA表達水平的影響 結(jié)論： （1）氧化應(yīng)激通過影響（

6、誘導(dǎo)或抑制）抗氧化應(yīng)激蛋白HO-1系統(tǒng)參與DM和DN的發(fā)生發(fā)展過程。 （2）HO-1在DM發(fā)展的不同時期分別具有促氧化和抗氧化的雙重作用，并因此參與線粒體某些抗氧化酶基因的調(diào)節(jié)。 （3）MG可以減輕腎臟的氧化應(yīng)激，在一定程度上阻止DN的發(fā)展。其抗氧化作用的發(fā)揮由HO-1介導(dǎo)。 第二部分、分子流行病調(diào)查研究 第一節(jié)、氧化應(yīng)激在T2DM發(fā)生發(fā)展進程中的作用 目的：以不同糖代謝狀態(tài)人群（正常糖耐量個體[

7、normal glucose tolerance，NGT]、IGR[IFG和/或IGT]以及新診斷的T2DM病人）為研究對象進行較大樣本量的流行病學(xué)研究，描述IGR和新診斷T2DM人群流行病學(xué)特點；探討氧化應(yīng)激與胰腺β細胞功能失調(diào)和IR的關(guān)系；闡明氧化應(yīng)激在T2DM發(fā)生過程中的作用，為T2DM前期病人預(yù)防T2DM的發(fā)生提供重要的理論依據(jù)。 方法：研究對象為2004年12月-2007年11月在華中科技大學(xué)同濟醫(yī)院內(nèi)科內(nèi)分泌實驗室做

8、口服糖耐量試驗（oral glucose tolerance test，OGTT）的門診病人和體檢中心年齡和性別匹配的正常個體，將所有研究對象按照美國糖尿病學(xué)會（American diabetes association，ADA）糖尿病診斷標準和OGTT結(jié)果分為3組：NGT組（1615例）、IGR組（371例）和新診斷T2DM組（1103例）。對個體進行問卷調(diào)查，分析NGT、IGR和T2DM人群人口學(xué)資料、行為和飲食習(xí)慣及家族史的差異；

9、用穩(wěn)態(tài)模式評估法（homeostasis model assessment，HOMA）評價IR和β細胞分泌功能；檢測不同糖代謝狀態(tài)人群的氧化應(yīng)激（MDA含量）與抗氧化狀態(tài)（GSH含量、SOD活性以及總抗氧化能力[total antioxidant capacity，TAC]）；采用彗星試驗評價DNA氧化損傷；并分析上述指標與IR和β細胞分泌功能的相關(guān)性。 結(jié)果： （1）研究人群的一般情況 （2）生化指標

10、（3）氧化應(yīng)激和抗氧化狀態(tài) （4）DNA氧化損傷 結(jié)論：本次研究通過大樣本的病例對照研究調(diào)查糖尿病前期病人（IGR）和新診斷T2DM病人體內(nèi)氧化應(yīng)激通路和DNA氧化損傷狀態(tài)，初步勾勒出T2DM發(fā)生的可能機制：即使在IGR狀態(tài)，輕度增高的空腹血糖或者餐后2h血糖也會導(dǎo)致氧化應(yīng)激增強或者抗氧化系統(tǒng)受損或者兩者皆有，隨后導(dǎo)致氧化性DNA損傷。而氧化性DNA損傷又引起胰腺β細胞功能紊亂，IR以及更為顯著的高血糖，這個惡性循環(huán)最終

11、導(dǎo)致DM的發(fā)生。 第二節(jié)、HO-1啟動子基因多態(tài)性與T2DM易感性的關(guān)聯(lián)研究 目的：以上述第一節(jié)中不同糖代謝狀態(tài)人群（NGT、IGR和新診斷的T2DM病人）為研究對象，初步評價個體HO-1的表達水平與不同糖代謝狀態(tài)的關(guān)系；進一步探討HO-1啟動子區(qū)域兩處基因多態(tài)性：(GT)n和T(-413)A SNP與IGR和T2DM發(fā)病的相關(guān)性，并對其功能相關(guān)性進行初步探討。 方法：采用流式細胞儀檢測個體外周血單核細胞（per

12、ipheral blood monouclear cells，PBMCs）HO-1表達水平；提取外周血細胞DNA，通過遺傳分析儀對(GT)n微衛(wèi)星多態(tài)性進行片斷分析，采用TaqMan探針法進行T(-413)A SNP基因分型；對兩處多態(tài)性位點進行連鎖分析（連鎖不平衡分析軟件[linkage disequilibrium analysis，LDA]）并構(gòu)建單體型（PHASE2.0軟件）；校正T2DM高危因素，分別評價這兩處多態(tài)性位點以及單

13、體型與IGR和T2DM發(fā)生的關(guān)聯(lián)；結(jié)合HO-1表達水平探討兩處多態(tài)性位點的功能相關(guān)性。 結(jié)果： （1）PBMCs HO-1表達水平：IGR和T2DM病人PBMCs HO-1表達水平較NGT組均明顯降低，P值均小于0.05。 （2）(GT)n微衛(wèi)星多態(tài)性與T2DM發(fā)生的關(guān)聯(lián)研究 （3）T(-413)A SNP與T2DM發(fā)生的關(guān)聯(lián)研究 （4）連鎖不平衡分析及單體型構(gòu)建 （5）功能學(xué)評價：

14、 結(jié)論： （1）(GT)n微衛(wèi)星多態(tài)性位點通過調(diào)節(jié)個體HO-1表達水平與IGR和T2DM的發(fā)生相關(guān)聯(lián)：長(GT)n片段（L，≥ 25次）攜帶者HO-1表達水平降低，其罹患IGR和T2DM的風(fēng)險性增加。 （2）(GT)n微衛(wèi)星多態(tài)性與T(-413)A SNP位點相互連鎖，單體型TL與高IGR和T2DM風(fēng)險相關(guān)。 （3）(GT)n微衛(wèi)星多態(tài)性位點在調(diào)節(jié)HO-1功能方面起主導(dǎo)作用。 （4）(GT)n微衛(wèi)星多態(tài)