稻瘟病菌幾丁質(zhì)酶和絲氨酸蛋白酶之水稻受體研究.pdf

1、稻瘟病菌(Magnaporthe orzae)引起水稻重要病害，是研究植物與病原微生物相互作用的重要模式生物。已知其在侵染水稻時分泌幾丁質(zhì)酶、絲氨酸蛋白酶，參與致病過程。前期研究表明稻瘟病菌幾丁質(zhì)酶和絲氨酸蛋白酶可能是稻瘟病的致病因子，然而，它們在病程中的作用機制未明，特別是如何介導寄主水稻的響應，尚無報道。本文利用酵母雙雜交系統(tǒng)以稻瘟病菌幾丁質(zhì)酶、絲氨酸蛋白酶作為誘餌蛋白，從水稻中篩選受體，研究兩個蛋白與候選受體的互作關系，并探討候選

2、受體水稻RNAi突變體在與稻瘟病菌互作過程的變化，從而進一步明確它們在抗病或致病過程中的作用。 酵母雙雜交獲得與稻瘟菌幾丁質(zhì)酶(MoChil)互作的陽性克隆18個，與稻瘟病菌絲氨酸蛋白酶(MoSPl)互作的陽性克隆12個，同時測序并對他們進行生物信息學分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MoChil和MoSPl篩選到了同一個受體甘露糖凝集素OsMbl1。通過GST pull-down驗證了MoChil可以與水稻甘露糖凝集素OsMbl1、金屬硫蛋白Os

3、Mtll和MoSPl與鋅指蛋白OsZfpl、甘露糖凝集素OsMbl1及All體外互作。Western bloting結(jié)果表明MoClul與OsMbl1和OsMtll間存在相互作用；MoSPl可以與OsZfpl、OsMbl1體外互作，但不能與All體外互作。 本文重點研究了OsMbl1分別與MoChil和MoSPl互作結(jié)構(gòu)域。首先，生物信息學分析表明，OsMBL1含有單子葉植物甘露糖結(jié)合凝集素家族結(jié)構(gòu)域，且該結(jié)構(gòu)域含有三個糖結(jié)合位

4、；與蒜、石斛、文殊蘭屬等其他單子葉植物甘露糖結(jié)合凝集素的序列一致性大于50％，并具有單子葉植物甘露糖結(jié)合凝集素保守酸性氨基酸的結(jié)合位點。通過構(gòu)建OsMBL1不同片段缺失突變體，經(jīng)GST pull-down方法來檢測其與MoChil和MoSPl的互作特性，結(jié)果表明在與幾丁質(zhì)酶互作的過程中他的三個結(jié)合位點G……GXXXD、GXGXXXEDE和GX[GAVIYWF][DNEW]是相互獨立的，都能各自發(fā)揮作用。然而它與絲氨酸蛋白酶互作結(jié)果卻表明

5、只有這三個位點同時存在時才能表現(xiàn)出活性。 本文還分析了MoSPl與OsZfpl的互作結(jié)構(gòu)域。生物信息學分析表明，OsZFPl含有一個C3HC4保守結(jié)構(gòu)域，C端位置有兩個跨膜螺旋序列，編碼α/β型、非分泌型蛋白。缺失突變和GST Pull-down分析表明，OsZfpl與絲氨酸蛋白酶的互作只需要其C3HC4結(jié)構(gòu)域，其N端和C端不是它們互作所必須的。 利用實時定量PCR技術檢測OsZFP1、All和OsMBL1基因在幾丁質(zhì)酶

6、和絲氨酸蛋白酶敲除突變體和野生型Guy11侵染后的水稻葉片中的表達情況，結(jié)果表明，在絲氨酸蛋白酶敲除突變體侵染后的水稻葉片中表達量與在野生型侵染后的水稻葉片中的表達量相比，OsMBL1在72小時前表現(xiàn)為下調(diào)，在96小時后表現(xiàn)為上調(diào)：OsZFPl都表現(xiàn)為下降；而All基因的表達量無多大差異。OsMBL1基因在幾丁質(zhì)酶敲除突變體侵染后的水稻葉片中的表達量先表現(xiàn)為下調(diào)，48小時后達到最小，接著又有所回升。與野生型侵染后的水稻葉片中的表達量相比