基于SP細胞分選法初步研究卵巢癌干細胞.pdf

1、卵巢癌是女性生殖器官常見腫瘤，發(fā)病率在婦科惡性腫瘤中列居第三，但其致死率卻為各類婦科腫瘤之首。當前，卵巢癌的治療手段主要包括手術、化療、放療、免疫治療、物理治療等，這些方法的基本思路是把腫瘤看作是一個均質性整體，以減少腫瘤細胞的數(shù)量，最大限度清除腫瘤病灶為目的。但是部分腫瘤細胞對化療、放療的抵抗從而造成腫瘤的復發(fā)是腫瘤治療的主要障礙。因此，探索卵巢癌發(fā)病機制，尋找其治療的新途徑，已成為進一步提高卵巢癌患者生存率的關鍵。 隨著干細

2、胞（Stem Cells，SC）研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)腫瘤是一種干細胞疾病。研究顯示，腫瘤組織中存在極少量的腫瘤干細胞（Tumor Stem Cell，TSC）或癌干細胞（Cancer Stem Cell，CSC），具有無限增生的潛能，對化療、放療具有抗性，在腫瘤中充當干細胞的角色，是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉移、復發(fā)及耐藥的決定性因素。以往對卵巢癌復發(fā)和轉移的研究忽視了CSC的存在及其重要性。由于CSC的存在，現(xiàn)有治療方法不能有效抑制卵巢

3、癌發(fā)生、轉移、耐藥以及復發(fā)。目前，從形態(tài)學上很難區(qū)分CSC與腫瘤細胞間的差異，只能用功能學方法即對其自我更新能力和分化潛力來鑒定CSC?，F(xiàn)分離CSC的方法主要有三種：側群（side population，SP）細胞分選法、無血清培養(yǎng)富集干細胞及通過CSC表面特異性標志篩選。其中SP細胞是指可將熒光染料Hoechst33342泵出細胞外，表現(xiàn)弱熒光信號的細胞群，占總體細胞的很少部分。多項研究表明，部分腫瘤（乳腺癌、前列腺癌、腦膠質瘤等）中

4、SP細胞具有CSC特性，表現(xiàn)為：表達SC相關表面標志、具有自我更新能力、強致瘤能力、高表達轉運蛋白ABCG2等。因此，我們利用SP細胞與SC、CSC具有許多共性的特點來富集分離CSC。在缺乏顯著的CSC分子標記的情況下，SP細胞的篩選分析，可以作為CSC鑒定的一種實用而簡易的重要方法之一。 本研究選擇人卵巢癌細胞系A2780為研究對象，對其內的SP和Non-SP細胞作細胞生物學特性鑒定，判斷SP細胞分選法能否作為分離卵巢CSC的

5、一種有效方法。隨后在SP細胞研究的基礎上探討ABCG2分子能否作為卵巢CSC表面特異性標志。 目的： 基于SP細胞分選法，鑒定A2780細胞株中SP細胞是否具有CSC特性，判斷SP細胞分選法能否作為分離卵巢CSC的一種有效方法。在SP細胞研究的基礎上，探討ABCG2分子陽性細胞的生物學特性，判斷ABCG2分子是否為卵巢CSC表面特異性分子標志。最后模擬體內環(huán)境對鑒定的具有耐藥性的細胞進行藥敏實驗，篩選出敏感的化療藥物，為

6、臨床靶向治療卵巢癌提供一定的指導。 方法： 1．基于FACS分選技術檢測并分選A2780細胞株中SP和Non-SP細胞。 2．SP和Non-SP細胞相關細胞生物學特性研究。分別從細胞增殖活性、體外克隆形成能力、裸鼠體內致瘤性、對化療藥物的耐受性及ABCG2分子表達水平這幾方面綜合鑒定卵巢癌中SP細胞與CSC的相關性。 3．免疫磁選技術分離獲取ABCG2分子陽性和陰性表型細胞。 4．ABCG2分子陽

7、性和陰性細胞相關細胞生物學特性研究。分別從細胞增殖活性、體外克隆形成能力、體內致瘤性、SP細胞表達情況、對化療藥物的耐受性及利用單抗封閉后陽性細胞的耐受性等方面綜合分析ABCG2分子在卵巢CSC中的作用。 5．在模擬體內環(huán)境的三維培養(yǎng)基中對ABCG2分子陽性和陰性的細胞進行藥敏實驗，篩選出對卵巢癌中ABCG2分子陽性細胞敏感的化療藥物。 結果： 1．FACS分選技術檢測出A2780細胞株中SP細胞比例約為2．6％

8、，將FACS圖中門區(qū)域的細胞分選下來，從1×107細胞中可得到約2×105個SP細胞。 2．對SP和Non-SP細胞進行相關細胞生物學特性研究，結果顯示：SP細胞在普通培養(yǎng)基上細胞增殖活力、在平板和軟瓊脂內的克隆形成能力均顯著高于Non-SP細胞；SP細胞在Balb/c裸鼠體內的致瘤能力、對化療藥物長春新堿的耐受性均顯著高于Non-SP細胞；SP細胞中ABCG2分子的表達量也顯著高于Non-SP細胞。 3．利用免疫磁選技

9、術分離獲取A2780細胞中ABCG2分子陽性表型細胞，1×107的A2780細胞可得到約2×105的ABCG2分子陽性細胞，即A2780細胞中ABCG2分子陽性表型細胞約占2％左右，其含量與SP細胞的比例相似。 4．對ABCG2分子陽性和陰性表型細胞進行相關細胞生物學特性研究，結果顯示：ABCG2分子陽性細胞普通培養(yǎng)基上的細胞增殖活力、在體外克隆形成能力、體內致瘤能力僅略高于ABCG2分子陰性細胞，但差異無統(tǒng)計學意義；ABCG2

10、分子陽性細胞中SP細胞含量明顯高于Non-SP細胞；ABCG2分子陽性細胞對化療藥物的耐受性明顯高于ABCG2分子陰性細胞，用ABCG2分子的單克隆抗體封閉ABCG2分子陽性細胞后其細胞耐受性明顯降低。 5．在三維培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)ABCG2分子陽性細胞對紫杉醇的敏感性明顯高于順鉑及阿霉素。紫杉醇較低劑量時就可明顯抑制ABCG2分子陽性細胞的增殖。 結論： 1．A2780細胞株中SP細胞的細胞生物學特性基本符合CSC。