脂肪干細胞治療小鼠卵巢早衰的初步研究.pdf

1、研究背景:卵巢早衰近年來發(fā)病率日益增高,與腫瘤患者治療方案(化療、放療)的不斷完善密不可分,有效的治療使得患者的長期生存率顯著提高。尤其是年輕的生育期腫瘤患者,由于放化療破壞了大多數(shù)的分裂細胞,化療后她們都可能會面臨閉經(jīng)、不孕不育以及卵巢早衰的問題。
　　目前臨床主要以雌孕激素替代療法和輔助生殖技術來治療卵巢早衰,免疫抑制治療主要用于免疫因素引起的卵巢早衰。但目前這些治療方法尚不能從根本上修復受損的卵巢功能,且長期應用還可能會引起

2、一些副作用。所以,怎樣提前預防和恢復衰退的卵巢功能,尋求新的治療方法,從而恢復患者的生育功能是科研工作者面臨的一個挑戰(zhàn)。
　　隨著對干細胞認識的不斷深入,其在醫(yī)學領域的巨大潛力被逐漸發(fā)掘出來。已有研究發(fā)現(xiàn),骨髓干細胞,臍帶干細胞等可以減少卵巢結構及功能損傷,而脂肪干細胞對卵巢早衰的治療作用尚不清楚。脂肪干細胞具有較低的免疫原性,來源豐富,獲取方便,生長迅速,可以作為自體移植的來源。許多研究報道,脂肪干細胞移植可以改善損傷組織的結構

3、和功能。本研究通過探討脂肪干細胞治療化療性及自身免疫性卵巢早衰及其機制,以期為卵巢早衰的治療提供一種新的思路和方法。
　　第一部分:脂肪干細胞對小鼠化療性卵巢早衰治療作用的初步研究
　　實驗目的:
　　建立小鼠化療性卵巢早衰模型,分離小鼠脂肪干細胞并探討其對化療性卵巢早衰的治療作用。
　　研究方法:
　　1.應用酶消化法分離小鼠脂肪干細胞,用流式細胞術對脂肪干細胞細胞表面標記進行鑒定,并通過誘導成骨、成脂來

4、鑒定干細胞多向分化的潛能。
　　2.采用腹腔注射化療藥物環(huán)磷酰胺的方法來建立小鼠卵巢早衰模型。并采用卵巢原位注射法及尾靜脈注射法進行移植。
　　3.分別于干細胞移植后1周、1月處死各實驗組小鼠,并取小鼠卵巢,通過HE染色法觀察各組卵巢卵泡形態(tài)及數(shù)目變化。
　　4.比較各組小鼠排卵數(shù)目和質量的變化。
　　5.Tunel染色觀察小鼠卵巢顆粒細胞凋亡的情況。
　　實驗結果:
　　1.經(jīng)體外培養(yǎng)及鑒定我們獲得

5、了性質穩(wěn)定的脂肪干細胞。
　　2.早衰組卵巢內(nèi)卵泡數(shù)量明顯減少;干細胞移植后各級卵泡數(shù)目明顯增多,治療后一周,原始卵泡和竇狀卵泡數(shù)目明顯升高,治療一月后,成熟卵泡數(shù)目也明顯升高。
　　3.與早衰組相比,移植組在移植一周及一月時小鼠排卵數(shù)目顯著增高。
　　4.移植后一周后小鼠卵巢中凋亡的顆粒細胞明顯減少。
　　結論:
　　脂肪干細胞對化療性卵巢早衰有一定的治療作用,在臨床應用方面具有潛在價值。
　　第二

6、部分:脂肪干細胞治療化療性卵巢早衰分子機制的初步研究
　　實驗目的:
　　探討脂肪干細胞治療化療性卵巢早衰的分子機制。
　　研究方法:
　　1.用綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)轉基因小鼠培養(yǎng)的脂肪干細胞移植治療卵巢早衰,追蹤其歸巢及定位情況。
　　2.通過基因芯片來研究脂肪干細胞移植對小鼠化療性卵巢早衰基因表達譜的影響。從而了解脂肪干細胞治療卵巢早衰的內(nèi)在機

7、制。
　　3.采用實時定量聚合酶鏈反應(quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction,qRT-PCR)以鑒定隨機選取的差異表達基因。
　　實驗結果:
　　1.移植后一周和一月均能在卵巢中追蹤到脂肪干細胞。
　　2.基因芯片結果顯示,與早衰組相比,治療后尾靜脈組有176個基因發(fā)生變化,原位注射組有225個基因發(fā)生變化,許多基因在卵泡發(fā)育及卵子形成中起重要作用。

8、r>　　3.qRT-PCR隨機挑選的差異基因表達變化與相應的基因芯片結果相一致。
　　結論:
　　脂肪干細胞對能通過調控某些基因來改善小鼠卵巢功能。脂肪干細胞分泌的細胞因子對修復卵巢功能也起到重要的作用。
　　第三部分:脂肪干細胞對小鼠免疫性卵巢早衰治療作用的初步研究
　　實驗目的:
　　建立小鼠卵巢早衰的免疫模型,移植ADSCs后觀察脂肪干細胞對小鼠自身免疫性卵巢早衰的初步治療作用。
　　研究方法:

9、
　　1.依據(jù)小鼠透明帶3(zonapellucida3,ZP3)的第330-342個氨基酸序列合成ZP3多肽,通過小鼠雙后掌皮下多點注射ZP3來建立卵巢早衰免疫模型。
　　2.干細胞治療組于免疫后14天原位注射脂肪干細胞。于干細胞移植后1周處死各實驗組小鼠,觀察小鼠動情周期及卵巢組織學變化,并比較各組小鼠卵巢抗透明帶抗體陽性率。
　　3.比較各組小鼠排卵數(shù)目和質量的變化。
　　4.用CM-Dil標記脂肪干細胞,

10、追蹤脂肪干細胞歸巢情況。
　　5.觀察各組小鼠顆粒細胞凋亡情況。
　　實驗結果:
　　1.皮下注射ZP3后,免疫模型組卵巢組織學表現(xiàn)以大量淋巴細胞和漿細胞浸潤為特征的自身免疫性卵巢炎。移植后小鼠自身免疫性卵巢炎明顯好轉,抗透明帶抗體陽性率降低。
　　2.移植后排卵率顯著增高。
　　3.移植一周及兩周后可在卵巢追蹤到CM-Dil陽性細胞。
　　4.移植一周后顆粒細胞凋亡減少。
　　結論