IL-17促進(jìn)CD133+卵巢癌干細(xì)胞樣細(xì)胞自我更新的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　卵巢癌目前是死亡率最高的婦科腫瘤疾病，發(fā)病隱匿、高復(fù)發(fā)及易擴(kuò)散轉(zhuǎn)移是其重要的臨床特征。越來越多的研究證明，惡性腫瘤組織中存在著一小部分擁有干細(xì)胞樣細(xì)胞性質(zhì)的群體，即腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)或稱為腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞(cancerstem-like cells，CSLCs)，其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)及侵襲轉(zhuǎn)移中起著十分重要的作用。在卵巢癌中也存在著腫瘤干細(xì)胞，即卵巢癌干細(xì)胞(ovari

2、an cancer stem cells，OCSCs)，其對(duì)卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移同樣具有重要作用。因此，從卵巢癌干細(xì)胞樣細(xì)胞這一角度進(jìn)行研究是治療卵巢癌的新策略。
　　腫瘤干細(xì)胞與普通腫瘤細(xì)胞相比，除了具有更強(qiáng)的侵襲、轉(zhuǎn)移能力，更強(qiáng)的化療抵抗能力以外，最本質(zhì)的差別是其具有干細(xì)胞特性，即自我更新(self-renewal)。不管是腫瘤的發(fā)生還是復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移灶的形成，都有賴于腫瘤干細(xì)胞的自我更新能力。因此，闡明腫瘤干細(xì)胞的自我

3、更新機(jī)制是研究腫瘤干細(xì)胞的關(guān)鍵。
　　腫瘤干細(xì)胞的自我更新不僅依賴于其自身內(nèi)在的信號(hào)調(diào)控，同時(shí)也受到腫瘤微環(huán)境的調(diào)控，其中，腫瘤相關(guān)性炎癥最為關(guān)鍵。然而腫瘤相關(guān)性炎癥對(duì)卵巢癌干細(xì)胞的自我更新調(diào)控作用及機(jī)制卻缺乏系統(tǒng)深入的研究。
　　我們前期從卵巢癌中成功分離出的CD133+卵巢癌干細(xì)胞樣細(xì)胞(CD133+ ovariancancer stem-like cells，CD133+ OCSLCs)具有腫瘤干細(xì)胞的特性，其能夠作為

4、我們研究卵巢癌干細(xì)胞自我更新生物學(xué)特性的模型。為此，本課題探討腫瘤相關(guān)性炎癥對(duì)CD133+OCSLCs自我更新的調(diào)控作用及其機(jī)制。
　　研究目的：
　　1.檢測(cè)CD133+ OCSLCs相關(guān)性炎癥因子及其受體的表達(dá)。
　　2.明確IL-17在CD133+ OCSLCs自我更新中的作用。
　　3.闡明IL-17調(diào)控CD133+ OCSLCs自我更新的機(jī)制。
　　研究方法：
　　圍繞上述研究目的，我們采用

5、以下研究方法:
　　一、CD133+ OCSLCs相關(guān)性炎癥因子及其受體
　　1.通過人炎癥反應(yīng)PCR芯片(Human Inflammatory Response PCR Array)技術(shù)，比較A2780卵巢癌細(xì)胞系來源的CD133+ OCSLCs和非OCSLCs(CD133-A2780卵巢癌細(xì)胞系細(xì)胞)中炎癥因子和相關(guān)受體mRNA的表達(dá)。
　　2.通過流式細(xì)胞、免疫熒光技術(shù)驗(yàn)證IL-17R在A2780卵巢癌細(xì)胞系，A

6、2780卵巢癌細(xì)胞系來源的CD133+ OCSLCs和人卵巢癌組織中的表達(dá)情況。
　　二、IL-17在CD133+ OCSLCs自我更新中的作用
　　1.通過免疫組化，免疫熒光技術(shù)檢測(cè)IL-17的來源細(xì)胞。
　　2.通過腫瘤干細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)及受體阻斷實(shí)驗(yàn)研究IL-17體外對(duì)A2780卵巢癌細(xì)胞系來源的CD133+ OCSLCs和原代卵巢癌細(xì)胞來源的CD133+ OCSLCs自我更新的作用。
　　3.通過構(gòu)建IL-1

7、7過表達(dá)慢病毒后裸鼠體內(nèi)荷瘤實(shí)驗(yàn)研究IL-17對(duì)A2780卵巢癌細(xì)胞系來源的CD133+ OCSLCs體內(nèi)成瘤能力的影響。
　　三、IL-17調(diào)控CD133+ OCSLCs自我更新作用的機(jī)制
　　1.通過全基因組表達(dá)譜芯片技術(shù)篩選IL-17調(diào)控A2780卵巢癌細(xì)胞系來源的CD133+ OCSLCs自我更新的相關(guān)基因并通過qPCR驗(yàn)證。
　　2.結(jié)合自我更新相關(guān)基因和生物信息學(xué)方法篩選IL-17下游信號(hào)通路。
　　

8、3.通過western-blot，免疫熒光和抗體阻斷等方法研究NF-κB及p38MAPK兩條信號(hào)通路在IL-17調(diào)控CD133+ OCSLCs自我更新中的作用。
　　研究結(jié)果：
　　1.CD133+OCSLCs表面表達(dá)IL-17R
　　我們通過PCR-array技術(shù)，比較了A2780卵巢癌細(xì)胞系來源的CD133+ OCSLCs和非OCSLCs之間的基因差異，結(jié)合這些差異基因的生物學(xué)作用，我們選擇對(duì)IL-17參與CD13

9、3+ OCSLCs自我更新進(jìn)行深入研究。
　　免疫熒光和流式細(xì)胞技術(shù)結(jié)果顯示A2780卵巢癌細(xì)胞系來源的CD133+ OCSLCs表面表達(dá)IL-17R并且其表達(dá)高于非OCSLC。在新鮮人卵巢癌組織中，通過免疫熒光發(fā)現(xiàn)IL-17R表達(dá)于原代卵巢癌來源的CD133+ OCSCs表面。提示IL-17與CD133+ OCSLCs具有相互作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　2.IL-17促進(jìn)CD133+ OCSLCs自我更新
　　因?yàn)镮L-1

10、7R需要與其配體IL-17相結(jié)合才能發(fā)揮功能，因此我們首先通過免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)人新鮮卵巢癌組織中存在表達(dá)IL-17的細(xì)胞，其主要分布于卵巢癌間質(zhì)內(nèi)。免疫熒光進(jìn)一步證實(shí):表達(dá)IL-17的細(xì)胞主要為CD4+T細(xì)胞和CD68+巨噬細(xì)胞，并且這類細(xì)胞與CD133+ OCSLCs在人卵巢癌組織中處于同一niche之中。提示IL-17與CD133+OCSLCs具有空間上相互作用的可能性。
　　通過衡量A2780卵巢癌細(xì)胞系和原代卵巢癌細(xì)胞來源

11、的CD133+ OCSLCs在IL-17刺激后的成球數(shù)量和成球大小，證明IL-17具有促進(jìn)CD133+ OCSLCs自我更新的作用，經(jīng)過IL-17R抗體阻斷實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明IL-17促進(jìn)CD133+ OCSLCs自我更新的作用依賴于IL-17R。
　　通過慢病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染方法建立穩(wěn)定表達(dá)人IL-17的CD133+ OCSLCs，結(jié)合免疫熒光和ELISA驗(yàn)證IL-17轉(zhuǎn)染效率，成球和受體阻斷功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證IL-17轉(zhuǎn)染后促進(jìn)CD13

12、3+ OCSLCs自我更新。通過裸鼠體內(nèi)荷瘤實(shí)驗(yàn)證明IL-17具有促進(jìn)CD133+ OCSLCs體內(nèi)成瘤的能力。
　　3.IL-17通過NF-κB和p38MAPK兩條信號(hào)通路調(diào)控CD133+ OCSLCs自我更新
　　通過基因表達(dá)譜芯片比較IL-17刺激和未刺激的卵巢癌細(xì)胞系來源的CD133+OCSLCs差異基因，在此基礎(chǔ)上分別通過:1.篩選出8個(gè)自我更新相關(guān)基因，qPCR驗(yàn)證后，通過在線轉(zhuǎn)錄因子查找的方法，證實(shí)p65和/或

13、AP1為8個(gè)自我更新相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄因子（除TCL1A）;2.生物信息學(xué)信號(hào)通路預(yù)測(cè)篩選出NF-κB和MAPK兩條信號(hào)通路。因?yàn)閜65和AP1分別是NF-κB和p38MAPK兩條信號(hào)通路的終末轉(zhuǎn)錄單位，提示NF-κB和p38MAPK兩條信號(hào)通路可能是IL-17促進(jìn)CD133+ OCSLCs自我更新的調(diào)控機(jī)制，其與生物信息學(xué)信號(hào)通路預(yù)測(cè)篩選出來的NF-κB和MAPK兩條信號(hào)通路相一致。
　　為了明確NF-κB和p38MAPK兩條信號(hào)通

14、路介導(dǎo)IL-17促進(jìn)CD133+ OCSLCs自我更新，我們通過western-blot、ELISA和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)p65和p38，發(fā)現(xiàn)CD133+OCSLCs在IL-17刺激5min后，p65和p38開始入核增加并伴隨著胞漿蛋白的相應(yīng)減少。為了進(jìn)一步確定NF-κB和MAPK兩條信號(hào)通路介導(dǎo)IL-17促進(jìn)CD133+ OCSLCs自我更新，在IL-17刺激CD133+ OCSLCs的情況下，分別加入p65阻斷劑PDTC和/或p38阻斷

15、劑SB203580，觀察成球數(shù)量，發(fā)現(xiàn)兩者阻斷劑能夠分別或協(xié)同抵制IL-17促進(jìn)CD133+OCSLCs的自我更新現(xiàn)象。由此在IL-17促進(jìn)CD133+ OCSLCs自我更新的過程中形成了一個(gè)由NF-κB和p38MAPK兩條信號(hào)通路介導(dǎo)的調(diào)控新機(jī)制。
　　研究結(jié)論：
　　在卵巢癌中，分泌IL-17炎癥細(xì)胞因子的CD4+T細(xì)胞和CD68+巨噬細(xì)胞與CD133+OCSLCs共同處于同一niche中，IL-17炎癥因子能夠與表達(dá)于