人卵巢癌HO8910細(xì)胞系中的腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞通過MMP促進(jìn)血管生成擬態(tài)的形成.pdf

1、目的：血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicry, VM）是存在于惡性侵襲性腫瘤中的特殊血液供應(yīng)方式。本實(shí)驗(yàn)通過無血清懸浮培養(yǎng)方法從人卵巢上皮性癌（簡稱卵巢癌）細(xì)胞株HO8910中分選腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞，并通過流式細(xì)胞術(shù)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證分選細(xì)胞的腫瘤干細(xì)胞樣特性。比較分選細(xì)胞與親代細(xì)胞形成 VM的能力，并檢測二者中基質(zhì)金屬蛋白酶2、9(matrix metalloproteinases-2,9;MMP-

2、2, MMP-9)基因的表達(dá)水平。
　　方法：
　　1.無血清懸浮培養(yǎng)：通過無血清富含多種細(xì)胞生長因子的干細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮培養(yǎng)親代HO8910細(xì)胞，并連續(xù)傳代，觀察懸浮細(xì)胞球隨著傳代的變化，拍照記錄，并收集一、三、五、七代懸浮細(xì)胞球進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。
　　2.流式細(xì)胞儀檢測第一、三、五、七代懸浮細(xì)胞中CD133+細(xì)胞的表達(dá)情況：使用CD133抗體標(biāo)記待檢測的各代細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀檢測，熒光信號強(qiáng)表達(dá)的為CD133陽性（CD

3、133+）細(xì)胞，熒光信號表達(dá)弱的為CD133陰性（CD133-）細(xì)胞，并計(jì)算各代中CD133陽性率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
　　3.體外平板克隆形成實(shí)驗(yàn)：比較親代HO8910細(xì)胞與第七代懸浮細(xì)胞的克隆形成能力，制備兩種細(xì)胞的單細(xì)胞懸液，以相同濃度的細(xì)胞分別接種在培養(yǎng)皿上，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1-2周，顯微鏡下觀察大于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)，并計(jì)算克隆形成率（CFE），實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
　　4.裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)：將親代細(xì)胞和第七代懸浮細(xì)胞球制備成單

4、細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為1×105、1×103個(gè)。重懸于0.2ml的PBS中，親代細(xì)胞接種于裸鼠的左側(cè)大腿皮下，第七代懸浮細(xì)胞接種于裸鼠的右側(cè)大腿皮下，共6只雌性裸鼠，觀察裸鼠每側(cè)皮下成瘤情況。
　　5.三維立體細(xì)胞培養(yǎng)并觀察 VM的形成情況：將親代細(xì)胞和第七代懸浮細(xì)胞球制備成單細(xì)胞懸液，分別接種于Matrigel基質(zhì)膠三維立體培養(yǎng)模型中，以相同間隔的時(shí)間在倒置相差顯微鏡下觀察 VM的形成情況，隨機(jī)取上、下、左、右、中五個(gè)視野拍照

5、記錄，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
　　6.實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time PCR, RT-PCR）：利用RT-PCR檢測親代細(xì)胞和第七代懸浮細(xì)胞球中MMP-2、MMP-9基因的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
　　7.統(tǒng)計(jì)方法：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(?x±s)表示，兩組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)；以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，當(dāng) P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，當(dāng) P>0.05，差異不具有統(tǒng)

6、計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.親代HO8910細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)
　　將親代 HO8910細(xì)胞置于無血清干細(xì)胞培養(yǎng)液中懸浮培養(yǎng)，24小時(shí)后，絕大部分細(xì)胞呈貼壁狀態(tài)，僅有一小部分細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后發(fā)現(xiàn)貼壁細(xì)胞逐漸死亡，而懸浮狀態(tài)的細(xì)胞增多，表現(xiàn)為幾個(gè)細(xì)胞聚集在一起的懸浮球。培養(yǎng)4-6天時(shí)，貼壁細(xì)胞已基本分解凋亡，懸浮細(xì)胞球隨著培養(yǎng)不斷增大、增多，且能連續(xù)傳至第七代。觀察發(fā)現(xiàn)第一代懸浮細(xì)胞球僅有幾個(gè)細(xì)胞組成，

7、大小一致，具有一定的折光性，細(xì)胞間連接緊密，但尚能分清細(xì)胞間界限。傳至第七代時(shí)，懸浮球由幾十個(gè)細(xì)胞組成，細(xì)胞間連接緊密，界限不清，折光性增強(qiáng)，立體感飽滿，但細(xì)胞大小和形態(tài)仍然保持和初代一致，此結(jié)果說明懸浮細(xì)胞具有很好的自我更新能力。
　　2.流式細(xì)胞檢測結(jié)果
　　流式細(xì)胞儀檢測第一、三、五、七代懸浮細(xì)胞球，發(fā)現(xiàn)CD133陽性細(xì)胞的表達(dá)水平隨著傳代次數(shù)呈上升趨勢，其陽性表達(dá)率分別為0.23％、31.74%、79.25%和88.

8、18%。
　　3.體外平板克隆形成率
　　平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果：第七代懸浮細(xì)胞球的克隆形成率為45.67±1.53%，而親代HO8910細(xì)胞的克隆形成率僅為11.00±2.00%，前者較后者約增加了4倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（t=23.859，P<0.00）。
　　4.裸鼠體內(nèi)成瘤能力的分析
　　將1×103個(gè)第七代懸浮細(xì)胞接種于雌性裸鼠右側(cè)大腿皮下，持續(xù)觀察6周后，6只裸鼠全部出現(xiàn)肉眼可見的移植瘤（6/6）。<

9、br>　　將1×105個(gè)親代HO8910細(xì)胞接種于雌性裸鼠左側(cè)大腿皮下，持續(xù)觀察6周后，未見裸鼠左側(cè)出現(xiàn)肉眼可見的移植瘤（0/6）。
　　5.三維立體細(xì)胞培養(yǎng)模型中VM的形成能力
　　在Matrigel基質(zhì)膠三維立體培養(yǎng)條件下，第七代懸浮細(xì)胞于2h可見細(xì)胞間產(chǎn)生連接，4h即可形成典型的VM網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)，此時(shí)細(xì)胞間聯(lián)系緊密，縱橫交錯(cuò)，48h典型的結(jié)構(gòu)方開始分散凋亡。親代細(xì)胞4h方見細(xì)胞間產(chǎn)生聯(lián)系，但連接松散不規(guī)則，8h細(xì)胞間聯(lián)系

10、最多，但典型的VM網(wǎng)格樣結(jié)構(gòu)較少，24h連接松散，開始凋落。
　　6.RT-PCR方法檢測MMP-2、MMP-9基因的表達(dá)情況
　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示：第七代懸浮細(xì)胞中MMP-2基因水平較親代 HO8910細(xì)胞提高了6.0倍，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-4.544， P=0.045）；第七代懸浮細(xì)胞中MMP-9基因表達(dá)較親代細(xì)胞提高了6.7倍，其差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-4.019, P=0.014）。
　　

11、結(jié)論：
　　1.親代 HO8910細(xì)胞在無血清富含細(xì)胞生長因子的培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)可得到懸浮細(xì)胞球，并可連續(xù)傳代，經(jīng)驗(yàn)證第七代懸浮細(xì)胞球可高表達(dá)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物CD133、有很強(qiáng)的克隆形成能力及裸鼠體內(nèi)成瘤能力，說明第七代懸浮細(xì)胞球具有腫瘤干細(xì)胞樣特性。
　　2.第七代懸浮細(xì)胞球較親代細(xì)胞有更強(qiáng)的VM形成能力，且高表達(dá)MMP-2、MMP-9。推測腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞可能通過高表達(dá) MMPs，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自身及細(xì)胞外基質(zhì)的重塑去促進(jìn)