KDEL受體蛋白通過(guò)自噬作用參與神經(jīng)退行性疾病的潛在功能研究.pdf

1、中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)博士學(xué)位論文KDEL受體蛋白通過(guò)自噬作用參與神經(jīng)退行性疾病的潛在功能研究姓名：汪平平申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：神經(jīng)生物學(xué)指導(dǎo)教師：王光輝2011-05摘 要 II 體的表達(dá)量的增加而更顯著。GFP-LC3 的熒光定位也由均勻的胞漿分布轉(zhuǎn)變成明亮的點(diǎn)狀分布。 使用透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)， 能夠發(fā)現(xiàn)其中大量雙層膜的自噬體結(jié)構(gòu)。這些結(jié)果說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)自噬體數(shù)量的增多。 在穩(wěn)定表達(dá)自噬經(jīng)典底物 GFP-p62 的細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)

2、 KDEL 受體能下調(diào)GFP-p62 的蛋白水平，而在 GFP-LC3 的細(xì)胞系中過(guò)表達(dá) KDEL 受體則會(huì)增加因降解切割而被釋放的游離 GFP 蛋白量。使用自噬溶酶體融合的抑制劑BafilomycinA1 或氯化奎寧(CQ)處理細(xì)胞檢測(cè) LC3 蛋白的 turnover，發(fā)現(xiàn) KDEL受體誘導(dǎo)的 LC3II 增加效應(yīng)依然存在。 這些結(jié)果表明 KDEL 受體蛋白能夠提高自噬的降解能力。因此，通過(guò)自噬體數(shù)量的增加和底物降解水平的提高可以確

3、定KDEL 受體能夠誘導(dǎo)細(xì)胞自噬水平的提高。 4. KDEL 受體過(guò)表達(dá)可以誘導(dǎo) MAPKs 家族成員 JNKs、 p38 以及 ERKs 的激活， 而 KDEL 受體誘導(dǎo)的 LC3II 增加效應(yīng)能夠被 MEK1/ERKs 的抑制劑 PD98059所抑制，但不受 JNKs、p38 抑制劑的影響，而在 EGFP-p62 細(xì)胞系中檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)PD98059 能夠抑制 KDEL 受體誘導(dǎo)的 p62 蛋白降解。這說(shuō)明 KDEL 受體誘導(dǎo)的自噬增強(qiáng)

4、是通過(guò) MEK1-ERKs 信號(hào)通路的激活介導(dǎo)。 5. 相對(duì)于正常的野生型， KDEL 受體蛋白功能缺陷的突變體 D193N、 R169N喪失了誘導(dǎo)活化 MEK1-ERKs 信號(hào)通路的能力， 同時(shí)也不能夠誘導(dǎo) LC3II 的上調(diào)以及對(duì) GFP-p62 的降解能力，因此 KDEL 受體的突變體不能夠通過(guò)激活MEK1-ERKs 信號(hào)通路來(lái)誘導(dǎo)自噬增強(qiáng)。 6. 同樣使用 RT-PCR 的方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)， 神經(jīng)退行性疾病相關(guān)突變蛋白的過(guò)表達(dá)，如

5、tHttQ150、α-synuclein A53T 以及 SOD1 G93A，都會(huì)誘導(dǎo) KDEL 受體的mRNA 含量的增加。我們?cè)谶@些突變蛋白的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系中過(guò)表達(dá) KDEL 受體可以促進(jìn)突變蛋白的降解，反之將內(nèi)源性 KDEL 受體 knockdown 后則造成這些突變蛋白量的累積。在自噬缺陷的 ATG5 KO 細(xì)胞中，過(guò)表達(dá) KDEL 受體則不能夠促進(jìn) SOD1 G93A 的降解。 因此，我們的研究結(jié)果表明，KDEL 受體蛋白通過(guò)