二化螟對(duì)醚菊酯的抗性及相關(guān)代謝酶基因的研究.pdf

1、二化螟屬于鱗翅目螟蛾科，在中國(guó)，是水稻上重要的鉆蛀性害蟲之一。分布廣泛，危害嚴(yán)重，除了危害水稻外，還能危害茭白等其他作物。在中國(guó)，常用化學(xué)藥劑來防治二化螟，長(zhǎng)期連續(xù)的使用殺蟲劑，必然使二化螟對(duì)許多常規(guī)藥劑產(chǎn)生了不同水平的抗性。為了延緩抗藥性的發(fā)展，亟需建立有效合理的抗性治理策略。研究二化螟抗藥性分子機(jī)制對(duì)于抗性治理策略的發(fā)展是非常重要的。本文監(jiān)測(cè)了不同地區(qū)二化螟對(duì)幾種常見殺蟲劑的抗性，對(duì)二化螟酯酶基因進(jìn)行了克隆和分析，協(xié)作完成了二化螟解

2、毒酶基因的組學(xué)分析，包括P450(CYP)基因和谷胱甘肽-s轉(zhuǎn)移酶(GST)基因，同時(shí)通過誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)研究了二化螟167條解毒代謝酶基因?qū)γ丫挣サ恼T導(dǎo)響應(yīng)，比較了不同抗性的二化螟種群中差異表達(dá)的解毒酶基因。本研究為闡明二化螟在中國(guó)的抗性狀況和制定有效的抗藥性監(jiān)測(cè)治理措施奠定了基礎(chǔ)。
　　1.二化螟對(duì)醚菊酯抗性的調(diào)查分析
　　首先利用野外種群和室內(nèi)敏感種群研究比較了兩種測(cè)定螟蟲抗藥性的方法，結(jié)果表明，初孵幼蟲藥膜法不僅簡(jiǎn)便，而且反

3、映二化螟的田間抗藥性更靈敏，可用于二化螟的抗性監(jiān)測(cè)。接著用初孵幼蟲藥膜法測(cè)定了我國(guó)7個(gè)不同地區(qū)二化螟對(duì)醚菊酯、丁烯氟蟲腈、阿維菌素及三唑磷的抗性水平，結(jié)果表明，以室內(nèi)敏感品系為對(duì)照，我國(guó)多數(shù)稻區(qū)的二化螟對(duì)三唑磷均產(chǎn)生了高水平抗性（48.0≤RR≤128.8），僅有四川萬(wàn)州等少數(shù)地區(qū)處于敏感-敏感下降水平（1≤RR≤4.0）。對(duì)丁烯氟蟲腈和阿維菌素，尚沒有發(fā)現(xiàn)顯著的抗性（0.1≤RR≤.7），但不同地區(qū)種群對(duì)丁烯氟蟲腈的耐藥力差異較大，其

4、原因有待進(jìn)一步分析。不同地區(qū)二化螟對(duì)醚菊酯的抗性與阿維菌素類似，僅有揚(yáng)州地區(qū)和浙江金華地區(qū)種群的二化螟表現(xiàn)為低水平抗性外（6.6≤RR≤8.8），其他地區(qū)的二化螟均處于敏感-敏感性下降階段（0.6≤RR≤3.8）。由此認(rèn)為，多數(shù)地區(qū)二化螟對(duì)生產(chǎn)中使用歷史較長(zhǎng)的有機(jī)磷類殺蟲劑三唑磷普遍產(chǎn)生了高抗，對(duì)新藥或殺蟲機(jī)理獨(dú)特的藥劑，抗性不明顯。醚菊酯作為鈉離子通道效應(yīng)劑，可以用來增加防治螟蟲藥劑的多樣性，以便在生產(chǎn)中通過輪換和混用，延緩抗性的發(fā)生

5、發(fā)展。但其室內(nèi)測(cè)定毒力較其他藥劑差，田間應(yīng)用尚需驗(yàn)證田間藥效。
　　2.二化螟酯酶基因的克隆和分析
　　酯酶(EST)是三種主要解毒代謝酶的重要一員，本研究在實(shí)驗(yàn)室已有工作的基礎(chǔ)上，利用二化螟的轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)，搜索驗(yàn)證獲得了28條新的EST基因，加上實(shí)驗(yàn)室成員之前所驗(yàn)證的17條酯酶基因，目前共發(fā)現(xiàn)45條酯酶基因，通過對(duì)這45條酯酶基因進(jìn)行BlastX，得出了45條二化螟酯酶基因與其他物種中相似度最高的酯酶基因，接著對(duì)已有

6、大于350 aa的EST基因進(jìn)行進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，二化螟EST基因27條長(zhǎng)序列中有7條與棉鈴蟲EST基因有對(duì)應(yīng)的同源基因，有1條與煙青蟲EST基因有對(duì)應(yīng)的同源基因，表現(xiàn)出明顯的親緣和適應(yīng)進(jìn)化關(guān)系。通過合作完成了二化螟三種解毒酶基因的組學(xué)分析，共鑒定了167種解毒酶基因，為進(jìn)一步深入研究二化螟解毒酶基因家族中各基因的具體功能奠定了基礎(chǔ)。
　　3.醚菊酯對(duì)二化螟解毒代謝酶系基因的誘導(dǎo)作用
　　外源化合物可以誘導(dǎo)昆蟲體內(nèi)的代謝酶，本

7、研究通過亞致死劑量處理二化螟，分析了醚菊酯對(duì)二化螟P450、EST和GST基因的誘導(dǎo)效應(yīng)。利用半定量PCR技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)有16條P450基因和14條EST基因誘導(dǎo)后表達(dá)上調(diào)。利用熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)上調(diào)2倍以上，且與對(duì)照差異顯著的有8條酯酶基因和3條P450基因，它們分別為CsuEst-3（2.1倍）、CsuEst-4（2.6倍）、CsuEst-7（2.4倍）、CsuEst-15(3.0倍)、CsuEst-24（2.2倍）、C

8、suEst-25（2.1倍）、CsuEst-37（4.2倍）、CsuEst-44(3.0倍)、CYP341（4.5倍）、CYP341B（2.5倍）和CYP304F13（2.0倍）。本研究初步認(rèn)為，這些解毒酶基因可能參與了醚菊酯的解毒代謝。
　　4.醚菊酯抗性二化螟的代謝酶基因表達(dá)差異
　　依據(jù)抗性監(jiān)測(cè)結(jié)果，選取了對(duì)醚菊酯具有不同抗性水平的地理種群，以室內(nèi)敏感品系（RR=1）為對(duì)照，比較檢測(cè)了南昌（RR=1.2）和金華（RR=

9、8.8）等不同抗性水平的地理種群中代謝酶的表達(dá)狀況。首先通過半定量PCR技術(shù)對(duì)45條酯酶（CusEst）基因，96條P450基因及26條谷胱甘肽-s轉(zhuǎn)移酶(GST)基因進(jìn)行篩選，接著利用熒光定量PCR技術(shù)驗(yàn)證半定量篩選出的表達(dá)差異的基因。結(jié)果沒有發(fā)現(xiàn)與醚菊酯抗性相關(guān)的解毒酶基因，這一方面是因?yàn)檠芯糠N群的醚菊酯抗性較低，另一方面是因?yàn)橐巴夥N群遺傳背景復(fù)雜，基因表達(dá)的影響因素較多，分析解毒酶與抗藥性的關(guān)系受到多種因素的干擾。但本研究發(fā)現(xiàn)金華