丙烯酰胺對(duì)斑馬魚胚胎致畸作用的研究.pdf

1、研究目的: 根據(jù)我國(guó)居民日常飲食中常見的丙烯酰胺(acrylamide，ACR)污染物，利用模式動(dòng)物斑馬魚對(duì)該化學(xué)物質(zhì)是否存在致畸效應(yīng)進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)，并對(duì)其致畸作用的分子基礎(chǔ)進(jìn)行初步研究，為我國(guó)孕婦丙烯酰胺發(fā)育暴露危險(xiǎn)度評(píng)價(jià)工作的開展，降低因食品丙烯酰胺導(dǎo)致的生育風(fēng)險(xiǎn)提供基礎(chǔ)。 研究方法: (1)采用不同濃度的丙烯酰胺進(jìn)行斑馬魚胚胎暴露處理，同時(shí)分別以維甲酸(Retinoid acid RA)和0.1％二甲基亞砜(

2、DMSO)處理的斑馬魚胚胎作為陽(yáng)性、陰性對(duì)照，通過活體成像技術(shù)觀測(cè)斑馬魚的心率、循環(huán)、紅細(xì)胞數(shù)、水腫、出血、腦室膨脹、腦壞死、下頜畸形、尾部形態(tài)和運(yùn)動(dòng)能力等指標(biāo)，計(jì)算畸形發(fā)生指數(shù)(teratogenic index，TI)；通過乙酰化的微管蛋白(acetvlated tubulin，a-AT)和神經(jīng)元增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)整體胚胎免疫染色，分別檢測(cè)ACR暴露后胚胎

3、的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元功能，神經(jīng)元的增殖狀態(tài)。 (2)通過Affymetrix寡核苷酸微陣列技術(shù)篩選ACR暴露后斑馬魚胚胎組織差異表達(dá)基因，利用Gene Ontology分析方法對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋和分類，采用K-means方法分析差異基因的表達(dá)模式，通過Pathway方法構(gòu)建基于信號(hào)通路的基因相互作用網(wǎng)絡(luò)；確定ACR致畸作用的候選靶基因，為進(jìn)一步研究ACR致畸的分子基礎(chǔ)提供依據(jù)。 (3)通過LNA(locked nucle

4、ic acid)修飾的microRNA(miRNA)探針行胚胎整體原位雜交技術(shù)，檢測(cè)斑馬魚胚胎暴露于ACR后神經(jīng)系統(tǒng)和心肌組織中miRNA的表達(dá)水平，初步確定ACR致畸作用的候選靶miRNA；生物信息學(xué)分析候選miRNA的靶基因與差異表達(dá)基因之間的關(guān)系，預(yù)測(cè)候選miRNA與其靶基因影響斑馬魚發(fā)育畸形的重要作用。 (4)通過顯微注射技術(shù)對(duì)候選靶miRNA進(jìn)行過表達(dá)(miR-124 duplex)和敲低(2‘甲氧基修飾的反義miR-

5、124)的實(shí)驗(yàn)，觀測(cè)斑馬魚的發(fā)育畸形效應(yīng)，以及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元功能和神經(jīng)元的增殖狀態(tài)，生物信息學(xué)分析篩選出對(duì)胚胎發(fā)育畸形有重要意義的miR-124靶基因，初步對(duì)候選靶miRNA進(jìn)行功能鑒定。 結(jié)果: (1)25-50mmol/LACR暴露處理的胚胎很快死亡，15mmol/LACR組表現(xiàn)出多系統(tǒng)的發(fā)育畸形，包括體短彎曲、心臟不發(fā)育或明顯減小等，5-10 mmol/LACR組主要表現(xiàn)為頭面部減小，胸鰭發(fā)育遲滯，尾部脊髓彎曲，體節(jié)減

6、少；在ACR暴露的胚胎于24小時(shí)(hours post fertilization，hpf)觀察發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組無(wú)差異，而在48hpf和96hpf則出現(xiàn)明顯的畸形；計(jì)算斑馬魚胚胎的死亡率和畸形率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在受精后48hpf和96hpf，ACR暴露的斑馬魚胚胎TI值均大于1，分別為4.4和3.6，而RA暴露的胚胎TI值分別為11.3和8.5；a-AT和PCNA整體胚胎免疫染色顯示：ACR處理組a-AT表達(dá)與正常組無(wú)差別，PCNA較正常組高表

7、達(dá)且隨著劑量的增加而表達(dá)增加。RA處理組a-AT表達(dá)降低且定位改變，PCNA表達(dá)與對(duì)照組差別不明顯。 (2)通過Affymetrix寡核苷酸微陣列分析ACR暴露的斑馬魚胚胎的基因表達(dá)情況，結(jié)果顯示上調(diào)基因77個(gè)，下調(diào)基因80個(gè)：通過Gene Ontology分析顯示，上調(diào)基因的功能主要是細(xì)胞的分化和組織化等方面，而下調(diào)基因的功能則主要是細(xì)胞增生和器官發(fā)育等；經(jīng)GCOS數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和數(shù)據(jù)注釋，篩選出一批對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)

8、育畸形有重大影響的侯選靶基因，包括mbtps、nkx2.5、tbx16、zar1、ttn、dcl、hsp70、ache、itgb4、glra4a、bcor和nol5a等；K-means聚類分析和GO富集分析發(fā)現(xiàn)具有相同表達(dá)模式的基因具有相同或類似的功能，變化程度顯著的基因其功能主要是組織器官發(fā)育和細(xì)胞通訊等，通過Pathway分析發(fā)現(xiàn)，ACR暴露誘導(dǎo)的差異表達(dá)基因參與Wnt、Notch和Tgf-β信號(hào)通路。 (3)利用LNA修

9、飾的mliRNA探針行胚胎整體原位雜交顯示，當(dāng)斑馬魚胚胎神經(jīng)系統(tǒng)和軟骨骨骼組織暴露于10mmol/L ACR中，可誘導(dǎo)miR-124、miR-125b、miR-9、miR-21、miR-140、miR-206不同程度的表達(dá)增加，而心肌組織中miR-1、miR-133a則表達(dá)降低；RA暴露的陽(yáng)性對(duì)照組則出現(xiàn)miR-1、miR-133a、miR-21、miR-124的表達(dá)增高，以及miR-140和miR-206表達(dá)的降低；經(jīng)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的

10、miR-140靶基因中，lmnb2、LOC554905、nr2f11、rnf11、siah1、zgc：92014、zgc：92331、mbtps2和fgf20在ACR暴露處理的斑馬魚胚胎均出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)，而miR-124的靶基因fn1表達(dá)上調(diào)、zorba、tcf2和zic2a下調(diào)。 (4)通過顯微注射對(duì)候選靶miR-124行過表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在24hpf斑馬魚出現(xiàn)體短、尾卷曲以及頭部分化異常等畸形，而敲低miR-124則無(wú)明顯異常；生物

11、信息學(xué)分析顯示，合合子期到口咽期miR-124的侯選靶基因在脊髓的表達(dá)的包括atp1b3a、fn1、atp6v1ba、jag2、zgc：85956、zic1和zic2a，在后腦表達(dá)的包括atp1b3a、atp6v1ba、jag2、midlip1和otx2等。 結(jié)論: (1)ACR對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育具有致畸作用和劑量依賴效應(yīng)，其中斑馬魚胚胎在高劑量暴露時(shí)主要表現(xiàn)為胚胎死亡，而低劑量暴露時(shí)則主要表現(xiàn)為胚胎發(fā)育畸形；ACR低劑量

12、暴露主要影響胚胎發(fā)育后期的神經(jīng)系統(tǒng)形態(tài)發(fā)生與分化，由此推測(cè)，ACR在體內(nèi)的代謝殘留物可能通過抑制細(xì)胞周期影響神經(jīng)細(xì)胞的增殖分化。 (2)在ACR致畸作用機(jī)制的研究中，一方面可以通過干擾Wnt、Notch和Tgf-β信號(hào)通路影響胚胎靶器官的發(fā)育；另一方面可以通過干擾發(fā)育重要基因的表達(dá)調(diào)控，如mbtps、nkx2.5和tbx16等，進(jìn)而影響隨后的胚胎靶器官的發(fā)育。 (3)神經(jīng)系統(tǒng)miRNA表達(dá)增加是ACR誘發(fā)斑馬魚胚胎畸形過