褪黑素對(duì)丙烯酰胺所致神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用的研究.pdf

1、本試驗(yàn)在ACR 導(dǎo)致PC12細(xì)胞氧化損傷的基礎(chǔ)上，研究MT對(duì)ACR所致氧化損傷的保護(hù)作用，以及對(duì)MT的可能的作用機(jī)制進(jìn)行探討，為防治丙烯酰胺中毒提供科學(xué)依據(jù)。
　　 第一部分、MT對(duì)ACR所致PC12細(xì)胞毒性的保護(hù)作用
　　 目的：探討MT對(duì)ACR 引起的PC12細(xì)胞毒性的保護(hù)作用。
　　 方法：設(shè)7個(gè)組，分別為空白對(duì)照組，溶劑對(duì)照組（0.1% 無(wú)水乙醇），MT組，Luzindole組，ACR組，ACR+MT組，

2、ACR+MT+Luzindole組，后三組中ACR 劑量分別為1.25、2.5、5、10、20、40 mmol/L，MT 終濃度為50 μmol/L，Luzindole 終濃度為0.2 μmol/L（MT和Luzindole 用無(wú)水乙醇助溶，無(wú)水乙醇含量為總體積的0.1％），處理24 h后以MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率。
　　 結(jié)果：ACR組2.5、5、10、20、40 mmol/L的細(xì)胞生長(zhǎng)率分別為89.04%、70.02%、55.

3、05%、44.34%、22.46% 顯著低于對(duì)照組，1.25 mmol/L細(xì)胞生長(zhǎng)率為93.31%，與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ACR組的細(xì)胞24 h IC50 為15.35 mmol/L。經(jīng)過(guò)濃度為50μmol/L的MT 預(yù)處理，1.25、2.5、5、10、20 mmol/L ACR 染毒計(jì)量的細(xì)胞存活率均比相應(yīng)ACR單獨(dú)處理的細(xì)胞存活率高，分別為157.84%、123.83%、109.36%、85.69%、57.98%，加入MT后24

4、 h IC50 升高為22.39 mmol/L。以濃度為0.2 μmol/L的ML1 受體阻斷劑Luzindole 阻斷后，1.25、2.5、5、10 mmol/L ACR 染毒的細(xì)胞存活率仍高于單純ACR 染毒組，但較MT 保護(hù)組低，具體數(shù)據(jù)分別為125.80%、116.16%、94.53%、62.37%，20、40mmol/L ACR 染毒的細(xì)胞存活率較MT 保護(hù)組低，與單純ACR 染毒組相近，為40.17%、17.76%，其24

5、h IC50 為14.37mmol/L。
　　 結(jié)論：一定濃度的ACR 能抑制PC12細(xì)胞的生長(zhǎng)，MT對(duì)ACR 導(dǎo)致的細(xì)胞毒性作用具有較好的保護(hù)作用，阻斷MT 受體ML1后，其保護(hù)作用基本消失。
　　 第二部分、MT對(duì)ACR所致PC12細(xì)胞氧化物質(zhì)生成的清除作用
　　 一、MT對(duì)ACR誘導(dǎo)的PPPPC12 C12細(xì)胞ROS 生成的清除作用
　　 目的：觀察MT對(duì)ACR誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞ROS 生成的清除作

6、用。
　　 方法：
　　 (1)觀察ACR對(duì)ROS 影響的時(shí)間-劑量-效應(yīng)關(guān)系。根據(jù)處理時(shí)間分為5個(gè)時(shí)間點(diǎn)（1 h，3 h，6 h，12 h，24 h），每時(shí)間點(diǎn)三個(gè)濃度組（1.25 mmol/L，2.5 mmol/L，5mmol/L），并設(shè)置一個(gè)空白對(duì)照組。
　　 (2)使用1.25 mmol/L和2.5 mmol/L的ACR 劑量染毒6 h，試驗(yàn)分為空白對(duì)照組，ACR組，ACR+MT組（50 μmol/L M

7、T 提前24 h，同時(shí)，推后3 h 干預(yù)），ACR+MT+Luzindole組（50 μmol/L MT和0.2 μmol/L Luzindole 提前24 h，同時(shí)，推后3 h 共同處理）。
　　 結(jié)果：
　　 (1)ACR組5 mmol/L ACR染毒1 h，3 h 較對(duì)照組ROS 水平有所升高，但24 h的ROS 水平下降，結(jié)合細(xì)胞存活率結(jié)果，認(rèn)為因染毒劑量高，細(xì)胞有死亡現(xiàn)象或細(xì)胞功能被抑制，出現(xiàn)活性氧水平下降。2

8、.5 mmol/L ACR染毒1 h，6 h ROS 水平高于對(duì)照組；1.25 mmol/L ACR 染毒在6 h和12 h時(shí)間點(diǎn)ROS 較對(duì)照組水平高。
　　 (2)提前24 h MT 干預(yù)1.25 mmol/L ACR 染毒6 h的細(xì)胞ROS 水平明顯低于ACR 染毒組，以Luzinddole 阻斷ML1 受體后與MT 干預(yù)組無(wú)顯著差別；MT 同時(shí)干預(yù)ACR，ROS 水平下降明顯，以Luzinddole 阻斷后，ROS 水平

9、上升顯著高于MT 干預(yù)組；MT 推后3 h 干預(yù)，發(fā)現(xiàn)并未能使ACR 染毒后ROS 水平降低。
　　 結(jié)論：
　　 (1)ACR對(duì)PC12細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的影響與其染毒劑量和染毒時(shí)間均有關(guān)，劑量高ROS 水平在短時(shí)間內(nèi)就有所升高，劑量低ROS 水平上升則需要作用一定的時(shí)間。
　　 (2)提前24 h和同時(shí)MT 干預(yù)，可使ACR所致的細(xì)胞內(nèi)ROS 水平升高有所改善，起到保護(hù)作用。受體阻斷劑對(duì)同時(shí)干預(yù)的MT 有顯著

10、的阻斷作用，對(duì)提前24 hMT 干預(yù)2.5 mmol/L ACR 染毒組也有阻斷作用，但對(duì)提前24 h 干預(yù)1.25 mmol/LACR 染毒組無(wú)明顯的阻斷作用。
　　 二、MT對(duì)ACR誘導(dǎo)PPPPC12 C12細(xì)胞MDA 生成的清除作用
　　 目的：觀察MT對(duì)ACR 引起的PC12細(xì)胞MDA 生成的清除作用。
　　 方法：
　　 (1)觀察ACR對(duì)MDA 影響的時(shí)間-劑量-效應(yīng)關(guān)系.根據(jù)處理時(shí)間分為5個(gè)

11、時(shí)間點(diǎn)（1 h，3 h，6 h，12 h，24 h），每時(shí)間點(diǎn)三個(gè)濃度組（1.25 mmol/L，2.5 mmol/L，5mmol/L），并設(shè)置一個(gè)空白對(duì)照組。
　　 (2)使用5 mmol/L ACR 染毒6 h，試驗(yàn)分為空白對(duì)照組，ACR組，ACR+MT組（50 μmol/L MT 提前24 h，同時(shí)，推后3 h 干預(yù)），ACR+MT+Luzindole組（50 μmol/LMT和0.2 μmol/L Luzindole 提

12、前24 h，同時(shí)，推后3 h 共同處理）。
　　 結(jié)果：
　　 (1)ACR單獨(dú)處理細(xì)胞，只有高濃度5 mmol/L ACR 染毒3 h，6 h，12 h，24 h組和對(duì)照組有顯著差異，其他組與對(duì)照組相比均無(wú)顯著性差異。
　　 (2)提前24 h MT 干預(yù)后MDA含量降低，明顯低于對(duì)照組和ACR單獨(dú)處理組，當(dāng)加入Luzindole后，MDA含量升高，與單純ACR 染毒無(wú)差異。MT 同時(shí)和推后3 h 干預(yù)，細(xì)胞內(nèi)

13、MDA含量無(wú)明顯改變。
　　 結(jié)論：
　　 (1)較高劑量的ACR（5 mmol/L）可使細(xì)胞中的MDA含量增加。
　　 (2)提前以MT 干預(yù)，對(duì)ACR 引起的細(xì)胞內(nèi)MDA含量的增加有所清除作用，Luzindole可阻斷MT的作用。
　　 第三部分：MT對(duì)ACR降低PC12細(xì)胞SOD含量的保護(hù)作用機(jī)制初探
　　 一、MT對(duì)ACR降低PC12細(xì)胞SOD含量的保護(hù)作用
　　 目的：觀察MT對(duì)

14、ACR降低PC12細(xì)胞SOD含量的保護(hù)作用。
　　 方法：
　　 (1)試驗(yàn)分為4組，一個(gè)對(duì)照組，和三個(gè)ACR 處理組，ACR 處理組濃度分別為1.25 mmol/L，2.5 mmol/L，5 mmol/L，染毒6 h。
　　 (2)使用5 mmol/L ACR 染毒6 h，試驗(yàn)分為空白對(duì)照組，ACR組，ACR+MT組（50 μmol/L MT 提前24 h，同時(shí)，推后3 h 干預(yù)），。
　　 結(jié)果：

15、r>　　 (1)以1.25，2.5，5 mmol/L ACR 分別處理6 h后，發(fā)現(xiàn)5 mmol/L ACR組的細(xì)胞SOD 相對(duì)含量明顯低于對(duì)照組。
　　 (2)MT 提前干預(yù)24 h后，細(xì)胞內(nèi)SOD 水平上升，明顯比ACR單獨(dú)處理組高。
　　 結(jié)論：
　　 (1)較高劑量的ACR（5 mmol/L）對(duì)細(xì)胞中的SOD含量有影響。
　　 (2)說(shuō)明MT 在提前作用的情況下對(duì)ACR 導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)SOD含量降

16、低有保護(hù)作用。
　　 二、MT對(duì)ACR降低PC12細(xì)胞SOD含量的保護(hù)作用機(jī)制研究
　　 目的：對(duì)MT 保護(hù)ACR 引起PC12細(xì)胞SOD含量降低的作用機(jī)制進(jìn)行初步的研究。
　　 方法：將細(xì)胞分為6個(gè)處理組，分別為對(duì)照組，ACR組，ACR+MT組(50 μmol/L MT提前24 h 干預(yù)，ACR 染毒6 h)，ACR+MT+Luzindole 處理組（0.2 μmol/L Luzindole與50 μmol/L

17、 MT 提前作用24 h），ACR+MT+PD98059（ERK 抑制劑）組（10 μmol/LPD98059與50 μmol/L MT 提前作用24h），ACR+MT+SB203580（p38 抑制劑）組（5μmol/L SB203580與50 μmol/L MT 提前作用24h），ACR 染毒6 h。
　　 結(jié)論：表明MT的作用能被MT 受體阻斷劑阻斷，而ERK和p38/MAPK 通路抑制劑對(duì)其沒(méi)有明顯的阻斷作用。