重組生長激素對(duì)手術(shù)創(chuàng)傷和腹腔感染時(shí)白蛋白合成率影響的研究.pdf

1、第一部分示蹤技術(shù)測定白蛋白合成率相關(guān)方法的建立 目的： 完善白蛋白提純和水解等方法；確定苯丙氨酸在氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀GC/MS下檢測條件和分析方法；建立穩(wěn)定性同位素示蹤劑測定白蛋白合成速率的方法。 方法： 1．血清白蛋白采用三氯乙酸/乙醇法提純，SDS-PAGE鑒定純度，Bradford法定量；采用HPLC法對(duì)水解液氨基酸進(jìn)行定量，固相萃取法對(duì)苯丙氨酸衍生前進(jìn)行處理。 2．應(yīng)用MSTFA對(duì)氨基酸進(jìn)

2、行衍生化，選取庚烷作為溶劑，GC自動(dòng)進(jìn)樣lul。 3．與譜庫進(jìn)行對(duì)比，確定衍生化產(chǎn)物的特征片段，對(duì)質(zhì)核比M+5，M+2和M+0的積分面積進(jìn)行比較，確定相對(duì)豐度表達(dá)方法。 4．白蛋白合成率分?jǐn)?shù)測定用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，再根據(jù)隨時(shí)間推移白蛋白和前體池中同位素相對(duì)豐度TTR的變化，計(jì)算FSR。 結(jié)果： 對(duì)提純后血漿白蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，發(fā)現(xiàn)在66KD處有純度較高條帶；Bradford法測定白蛋白濃度為0.9mg/

3、ml；HPLC法測定水解液中氨基酸濃度為0.6umol/L；衍生化產(chǎn)物為化產(chǎn)物為N，O-雙三甲基硅炕基-L-苯丙氨酸和N，O-雙三甲基硅烷基-[2H5]-L-苯丙氨酸；選取質(zhì)核比197/194作為相對(duì)豐度TTR指標(biāo)：前體池中苯丙氨酸TTR在輸注實(shí)驗(yàn)后1h達(dá)到平臺(tái)期，此時(shí)并入白蛋白苯丙氨酸TTR的增加成線性，基于此計(jì)算出的正常新西蘭兔在給予腸外營養(yǎng)情況下的白蛋白合成率分?jǐn)?shù)為17.26±0.92(n=8)。 結(jié)論： 1．白蛋

4、白的提純和水解方法以及氨基酸衍生化方法達(dá)到測定白蛋白FSR的要求。 2．用于測定穩(wěn)定性同位素示蹤劑的GC/MS條件穩(wěn)定，分析數(shù)據(jù)方法可靠。 3．穩(wěn)定性同位素示蹤劑[2H5]-L-苯丙氦酸測定白蛋白合成率分?jǐn)?shù)的方法可行，為進(jìn)一步評(píng)估手術(shù)和感染等應(yīng)激時(shí)白蛋白合成速率變化提供技術(shù)支持。 第二部分生長激素對(duì)手術(shù)創(chuàng)傷和腹腔感染時(shí)白蛋白合成率的影響 目的： 改良盲腸結(jié)扎穿孔的新西蘭兔模型，建立取血和營養(yǎng)輸注途

5、徑；通過已建立的穩(wěn)定性同位素示蹤技術(shù)評(píng)估腹腔感染和手術(shù)應(yīng)激對(duì)動(dòng)物白蛋白合成率分?jǐn)?shù)的影響；評(píng)估重組人生長激素對(duì)腹腔感染持續(xù)狀態(tài)白蛋白合成代謝的作用。 方法： 1．腹腔感染模型的制作采用改良后的盲腸結(jié)扎穿孔法，腹腔感染引流術(shù)去除腹腔感染，頸外靜脈置管和彈簧固定的方法分別用于取血和營養(yǎng)液的輸注。 2．新西蘭兔隨機(jī)分為四組，即正常合成率組、假手術(shù)組、腹腔感染組和生長激素干預(yù)組；腹腔感染組和生長激素干預(yù)組在第一次同位素輸注

6、實(shí)驗(yàn)結(jié)束后實(shí)施腹腔感染引流術(shù)；四組動(dòng)物均給予全胃腸外營養(yǎng)支持(TPN)；分別在術(shù)前、術(shù)后第1天和第4天對(duì)一般指標(biāo)(體重，血清白蛋白濃度等)進(jìn)行檢測。 3．生長激素干預(yù)組于第一次輸注實(shí)驗(yàn)后每晚0：00給予肌肉注射生長激素0.3u/kg，其他組給予安慰劑。 4．穩(wěn)定性同位素標(biāo)記物[2H5]L-苯丙氨酸注射液經(jīng)滅菌和除熱源處理，根據(jù)體重計(jì)算給藥劑量，將同位素混入腸外營養(yǎng)中經(jīng)耳緣靜脈微量注射泵輸入體內(nèi)。自穩(wěn)定性同位素輸注實(shí)驗(yàn)開始

7、后，每小時(shí)取血3ml，直至6小時(shí)后實(shí)驗(yàn)結(jié)束。 5．白蛋白合成率分?jǐn)?shù)測定用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，根據(jù)隨時(shí)間推移并入白蛋白和前體池中同位素相對(duì)豐度TTR的變化，計(jì)算FSR，并進(jìn)行組內(nèi)和組間比較。 結(jié)果： 本研究發(fā)現(xiàn)盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)后1天，新西蘭兔腹腔粘連較重，腸系膜和腸管充血水腫，腹腔有膿性積液；取血和營養(yǎng)輸注方法可有效維持4天以上；對(duì)動(dòng)物體重和血清白蛋白濃度的變化進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)腹腔感染組第4天體重和血清白蛋白濃度較術(shù)前顯著下

8、降(p值分別為0.037和0.001)；各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物白蛋白FSR的組內(nèi)比較，發(fā)現(xiàn)生長激素組FSR第4天顯著高于第1天(p=0.006)；四組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自蛋白FSR的組間比較，發(fā)現(xiàn)第1天四組間FSR有差異(F=33.687，p＜0.001)，其中假手術(shù)組、腹腔感染組和生長激素組的FSR均較正常組高(p＜0.05)；腹腔感染組和生長激素組較假手術(shù)組高(p＜0.001)；第4天四組間FSR差異顯著(F=65.794，p＜0.001)，腹腔感染組

9、高于正常組(p=0.001)和假手術(shù)組(p=0.002)；生長激素組則高于其他三組(p＜0.001)。 結(jié)論： 1．改良后的盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)可有效的形成腹腔感染，取血和輸注裝置的改良可以滿足實(shí)驗(yàn)需要。 2．手術(shù)和腹腔感染應(yīng)激早期白蛋白合成率加快，兩者的疊加效應(yīng)可將白蛋白合成與分解代謝率推向更高的水平。 3．手術(shù)和腹腔感染應(yīng)激持續(xù)期白蛋白合成率仍處于高水平，但由于分解速率處于更高水平，機(jī)體不能維持此時(shí)血清白蛋