生長(zhǎng)激素釋放肽的固相合成.pdf_第1頁(yè)
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1、重組人生長(zhǎng)激素(rhGH)在臨床有著十分廣闊的應(yīng)用前景,在肯定rhGH療效的同時(shí),出現(xiàn)的抗體形成、胰島素耐受、甲狀腺機(jī)能減退、價(jià)格昂貴、長(zhǎng)期注射不便等問(wèn)題也引起了人們的關(guān)注[1]。因此,研究人員積極尋找更簡(jiǎn)便、更有效的能夠促進(jìn)垂體生長(zhǎng)激素分泌的藥物。1982年,研究人員在腦啡肽類似物結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上合成了第一個(gè)對(duì)生長(zhǎng)激素分泌有刺激效應(yīng)的非天然生物活性肽,此肽由6個(gè)氨基酸組成,其中包含兩種D型氨基酸,稱為生長(zhǎng)激素釋放肽-6(Growth ho

2、rmone releasing peptide-6, GHRP-6)[2]。隨后幾年,研究組又在 GHRP-6的基礎(chǔ)上合成了七肽的GHRP-1和六肽的GHRP-2,這兩種活性肽刺激生長(zhǎng)激素分泌的作用較GHRP-6更強(qiáng)[3-4]。這幾種 GHRP除了有較強(qiáng)的促進(jìn)生長(zhǎng)激素釋放的作用外,GHRP對(duì)心血管功能、攝食、脂肪細(xì)胞分化、胃酸分泌和胃腸運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)等作用也引起了人們注意,尤其是 GHRP對(duì)心臟功能多方面的調(diào)節(jié)和改善作用成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)

3、[5]。GHRP沒(méi)有物種專一性,在動(dòng)物體內(nèi)具有促進(jìn)生長(zhǎng)激素釋放、刺激動(dòng)物食欲、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、影響動(dòng)物生產(chǎn)性能和提高動(dòng)物免疫水平等多方面的功能,GHRP的研究發(fā)展對(duì)畜牧業(yè)生產(chǎn)也具有十分重要的意義[6]。
  目前,國(guó)內(nèi)外對(duì) GHRP的作用機(jī)制、生理作用等進(jìn)行了大量的理論和實(shí)踐研究,國(guó)內(nèi)在上世紀(jì)90年代已有Boc固相合成策略合成GHRP-6的報(bào)道[7]。近來(lái)研究多集中在GHRP藥理研究上,在此基礎(chǔ)上,探索GHRP的合成方法,優(yōu)化合成工

4、藝,降低合成成本,成為越來(lái)越重要的課題。GHRP通過(guò)大量的結(jié)構(gòu)改造而來(lái),含有多種芳香族氨基酸,其序列中的D型氨基酸能夠有效地抑制蛋白酶的識(shí)別和水解,使其各種給藥途徑的利用率比其他肽類藥物都高,對(duì)維持多肽的生物活性起著重要作用[8]。本課題采用Fmoc固相合成策略,以Rink Amide-AM樹(shù)脂為載體,選擇碳二亞胺型縮合試劑DIC,在活化中添加HOBt試劑減少消旋副反應(yīng),逐步縮合完成接肽反應(yīng),通過(guò)幾種不同的切割試劑將粗肽從樹(shù)脂上切割下來(lái)

5、,比較其切割效果。粗肽經(jīng)半制備高效液相色譜儀分離純化,再冷凍干燥得到最終產(chǎn)物。得到的純肽用 RP-HPLC進(jìn)行純度分析,ESI-MS進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析鑒定。
  目的:
  采用Fmoc固相多肽合成方法合成GHRP-6、GHRP-1和GHRP-2三條短肽,探索影響產(chǎn)物結(jié)果的合成條件、切割條件和純化方法;確立產(chǎn)物的檢測(cè)方法;降低合成成本,得到純度較高的目標(biāo)產(chǎn)物。
  方法:
  1 GHRP的固相合成
  以Fmo

6、c固相合成方法分別合成GHRP-6、GHRP-1與GHRP-2。以合適的樹(shù)脂為載體,選擇能夠產(chǎn)生較低消旋率的縮合試劑,控制投料摩爾比和反應(yīng)時(shí)間,規(guī)范操作,減少接肽反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物;通過(guò)茚三酮檢測(cè)反應(yīng)的顏色變化判斷接肽過(guò)程中氨基酸的連接程度;探索樹(shù)脂替代度對(duì)合成反應(yīng)的影響。
  2 GHRP的切割、純化
  根據(jù)氨基酸不同的保護(hù)集團(tuán),選擇不同的切割試劑配方,進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn);優(yōu)化切割條件,選擇簡(jiǎn)便、副反應(yīng)較少的切割方法;切割

7、下來(lái)多肽經(jīng)過(guò)冰乙醚沉淀,離心收集產(chǎn)物得到粗肽;采用半制備型RP-HPLC分離純化;簡(jiǎn)單處理純化后產(chǎn)物后經(jīng)冷凍干燥得到最終產(chǎn)品。
  3 GHRP的結(jié)構(gòu)分析鑒定
  通過(guò)RP-HPLC對(duì)合成的GHRP-6、GHRP-1和GHRP-2的保留時(shí)間進(jìn)行定位、純度分析,對(duì)不同切割試劑的切割效果的HPLC圖譜進(jìn)行比較,對(duì)純化前和純化后的多肽HPLC圖譜進(jìn)行比較;用ESI-MS分析確證分子量。
  結(jié)果:
  1 GHRP為肽

8、酰胺的結(jié)構(gòu),選擇Rink Amide-AM樹(shù)脂為載體;縮合體系選擇DIC/HOBt,價(jià)格低廉,且兩者配合使用能有效的降低消旋率,可以將副反應(yīng)控制在很低的范圍內(nèi);反應(yīng)投料摩爾比在1:4時(shí)能夠反應(yīng)充分;反應(yīng)時(shí)間一般150min,在連接Phe,His等這些易發(fā)生消旋副反應(yīng)的氨基酸時(shí),避免高溫反應(yīng)環(huán)境,縮短反應(yīng)時(shí)間在120min左右;替代度在0.45mmol/g時(shí)合成效果較好。
  2 GHRP-6的3種切割試劑脫除保護(hù)基效果相似,所得產(chǎn)

9、物純度也較相近,其中切割溶液TFA:間甲酚(V/V99:1)的配比是最簡(jiǎn)便的,成本也最小。GHRP-1、GHRP-2所用兩種切割試劑也能起到很好的效果。切割實(shí)驗(yàn)進(jìn)行時(shí),反應(yīng)液先在冰浴中反應(yīng)0.5h,再30℃反應(yīng)1h的裂解條件得到的產(chǎn)物副產(chǎn)物少,得率較高。
  3合成的六肽的GHRP-6、GHRP-2和七肽的GHRP-1經(jīng) RP-HPLC檢測(cè)、ESI-MS確定分子量,合成正確;GHRP-6和 GHRP-2經(jīng)半制備RP-HPLC分離純

10、化后純度大于95%,GHRP-1的純度大于85%。
  結(jié)論:
  本課題采用 Fmoc固相多肽合成方法合成了六個(gè)氨基酸組成的短肽GHRP-6、GHRP-2和七個(gè)氨基酸組成的短肽GHRP-1,三條肽中均含有D型非天然氨基酸;在合成中通過(guò)選擇消旋率小的縮合試劑,控制反應(yīng)時(shí)間來(lái)減少副反應(yīng);比較了幾種不同的切割試劑對(duì)肽樹(shù)脂的切割效果,優(yōu)化了切割條件;半制備RP-HPLC分離、純化得到目標(biāo)產(chǎn)品純度能夠達(dá)到95%以上;所得產(chǎn)物經(jīng)RP-

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