大葉紫珠總黃酮抗氧化活性及抗魚藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　探討大葉紫珠總黃酮（Total Flavonoids from Callicarpa macrophylla，TFCM）體外抗氧化活性以及對魚藤酮（Rotenone，Rot）誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷的機(jī)制。
　　方法：
　　1. TFCM含量測定及體外抗氧化活性評價(jià)：（1）用NaNO2––Al(NO3)3–NaOH法測定TFCM含量。（2）以維生素C、BHT為對照，測定還原力，清除DPPH自由基、· O

2、H自由基、O2-自由基及H2O2的能力來評估體外抗氧化能力。
　　2. TFCM對魚藤酮誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷的影響：將SH-SY5Y細(xì)胞分為正常組，模型組，TFCM低、中、高劑量組，TFCM低、中、高劑量組分別給予30、60、90mg/L劑量TFCM處理細(xì)胞，24h后與模型組同樣用終濃度為20μM魚藤酮作用24小時(shí)。用MTT法測定細(xì)胞存活率，TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡率。
　　3. TFCM對魚藤酮誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞

3、損傷相關(guān)基因表達(dá)及SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影響：將SH-SY5Y細(xì)胞分為正常組，模型組，TFCM低、中、高劑量組，TFCM低、中、高劑量組分別給予30、60、90mg/L劑量TFCM處理細(xì)胞，24h后與模型組同樣用終濃度為20μM魚藤酮作用24小時(shí)。黃嘌呤氧化酶法（羥胺法）測細(xì)胞中SOD活力，硫代巴比妥酸法（TBA）測細(xì)胞中MDA含量，定量分析降低的谷胱甘肽與氧化的谷胱甘肽的比值來測定GSH-Px的活力，免疫熒光法及 We

4、stern Blot法檢測凋亡相關(guān)基因 Mcl-2、Cleaved caspase-3的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.（1）以蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)對照，采用NaNO2––Al(NO3)3–NaOH法測得TFCM含量為81.19％。（2）體外抗氧化結(jié)果表明，在還原力測定試驗(yàn)中，還原力強(qiáng)弱順序?yàn)門FCM

5、順序?yàn)門FCM<維生素C。在過氧化氫清除體系中，過氧化氫清除強(qiáng)弱順序?yàn)門FCM<維生素C，但二者的清除能力無顯著性差異。
　　2. TFCM對Rot誘導(dǎo) SH-SY5Y損傷的影響：不同劑量魚藤酮作用SH-SY5Y細(xì)胞24h后，MTT法測細(xì)胞存活率，顯示1μM、5μM、10μM、15μM、20μM、25μM處理組的細(xì)胞存活率分別為（75.20±4.29）%、（67.20±8.43）%、（63.40±8.15）%、（58.30±5.9

6、4）%、(50.50±5.85)%、(39.00±2.69)%，與正常組相比，細(xì)胞存活率顯著降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01），故選擇終濃度20μM魚藤酮處理構(gòu)建SH-SY5Y細(xì)胞損傷模型。將SH-SY5Y細(xì)胞給予TFCM（60、90mg/L）處理24h后，用終濃度為20μM魚藤酮作用24h，MTT法檢測細(xì)胞存活率結(jié)果顯示，TFCM給藥組(60、90mg/L)與模型組比較，其存活率明顯增高，且有劑量依賴性（P<0.05）；TUNEL法

7、檢測結(jié)果顯示模型組TUNEL陽性細(xì)胞較多，凋亡率為（61.8±6.0）%，TFCM給藥組（60、90mg/L）凋亡率分別為（28.2±8.0）%、（16.7±6.0）%，與模型組比較凋亡率顯著降低（P<0.01），且均呈劑量依賴性。
　　3. SOD、GSH-Px活性和MDA含量檢測結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組SOD、GSH-PX活性明顯降低，MDA含量明顯上升，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；TFCM給藥組（60、90mg/L

8、）與模型組比較，SOD、GSH-Px活性明顯升高，MDA含量明顯下降(P<0.01或P<0.05)，呈劑量依賴性。Western Blot法檢測顯示，與正常組比較，模型組Mcl-1蛋白表達(dá)明顯下降, Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯升高（P<0.01），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組比較，TFCM處理組（60、90mg/L） Mcl-1蛋白表達(dá)升高（P<0.05或P<0.01）, Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)降

9、低（P<0.05或P<0.01），且呈劑量依賴性。免疫熒光法檢測結(jié)果表明：正常組細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則, Mcl-1在細(xì)胞核核膜上有明顯表達(dá)，CC3表達(dá)較低；經(jīng)魚藤酮處理后的模型組，細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則，Mcl-1表達(dá)水平呈明顯降低，CC3在細(xì)胞核中有明顯表達(dá)，與模型組比較，TFCM給藥組（60、90mg/L）的Mcl-1表達(dá)水平逐漸上升，CC3表達(dá)水平逐漸降低，呈劑量依賴性。
　　結(jié)論：
　　1. TFCM有一定的的體外抗氧化活性。<