竹節(jié)參總提物對h2o2誘導sh-sy5y神經細胞損傷的保護作用

1、竹節(jié)參總提物對竹節(jié)參總提物對H2O2誘導誘導SHSY5YSHSY5Y神經細胞神經細胞損傷的保護作用損傷的保護作用楊莉，袁丁，代艷文，狄國杰，張長城，劉朝奇，王婷（443002湖北宜昌，三峽大學醫(yī)學院）[摘要]目的觀察竹節(jié)參總提物對過氧化氫(H2O2)誘導的SHSY5Y人神經瘤母瘤細胞損傷的保護作用。方法細胞分為正常對照組，H2O2（600moLL）處理組和H2O2竹節(jié)參總提物(0.1、1、5、20gmL）預處理組。體外培養(yǎng)SHSY5Y細

2、胞，加入竹節(jié)參總提物孵育12h，再加入H2O2作用12h建立氧化損傷模型。顯微鏡觀察細胞形態(tài)，應用MTT檢測細胞活力，酶生化法檢測乳酸脫氫酶（LDH）釋放量、超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛（MDA）含量，DCFADA探針檢測細胞內活性氧（ROS），流式細胞術檢測細胞凋亡率。結果與H2O2組比較，竹節(jié)參總提物各劑量組較H2O2組的細胞存活率上升，分別上升了14.4%、29.88%、32.48%、38.98%（P0.05）；LDH釋放

3、量下降，其中5、20gmL分別下降了60.19%和57.71%(P0.05)；SOD活力顯著升高，竹節(jié)參總提物1、5、20gmL較模型組上升了66.25%、56.37%和80.94%（P0.05）；MDA含量顯著降低，竹節(jié)參總提物1、5、20gmL較模型組下降了51.52%、86.28%和87.54%（P0.01）；ROS熒光強度及細胞凋亡率也顯著降低。結論竹節(jié)參總提物對H2O2誘導的SHSY5Y細胞損傷具有保護作用，其機制可能是通過增

4、強細胞的抗氧化能力從而減輕H2O2誘導的細胞凋亡。[關鍵詞]竹節(jié)參總提物；H2O2；氧化應激；凋亡[中圖法分類號][文獻標志碼]A[基金項目]國家自然科學基金（81100957）；湖北省自然科學基金（2010CDB10703）；三峽大學博士啟動基金（KJ2009B077）[通信作者]王婷，電話：（0717）6397466，Email:tingting0301@神經退行性疾病是一類嚴重危害人類健康的常見病。氧化應激在神經退行性疾病的發(fā)病中

5、發(fā)揮著重要作用[1]。氧化應激是在機體受到有害刺激時，體內的自由基產生過多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)失衡，從而導致組織損傷引發(fā)一系列疾病[2]。竹節(jié)參是我國常見的中草藥，據2010版中國藥典記載，竹節(jié)參具有散瘀止血、消腫止痛、祛痰止咳、補虛強壯的功效。有研究表明竹節(jié)參總提物（PanaxJaponicusextractPJE）具有較好的抗氧化活性[3]及清除自由基的功效[45]。但竹節(jié)參總提物對神經細胞氧化應激損傷的

6、保護作用鮮有報道，基于此本文采用體外培養(yǎng)SHSY5Y細胞，給予竹節(jié)參總提物后用H2O2刺激，觀察竹節(jié)參總提物的保護作用，為抗神經退行性疾病藥物的研發(fā)提供理論基礎。1材料與方法材料與方法1.11.1材料材料人神經瘤母瘤細胞（SHSY5Y）由華中科技大學同濟醫(yī)學院惠贈。細胞以含10%胎牛血清DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中。竹節(jié)參總提物：取竹節(jié)參干燥根莖粗粉，加入60%乙醇加熱回流3次，合并濾液后濃縮干燥，得到竹節(jié)參總提物

7、粉末，得率為25.8%。雙氧水（H2O2，北京化工廠生產）；DMEM培養(yǎng)基（Gibico公司）；胎牛血清（杭州天杭生物科技有限公司）；胰蛋白酶（Gibico公司）；四甲基偶氮唑鹽（MTT，Sigma公司）；活性氧檢測試劑盒（碧云天生物技術研究所）；AnnexinⅤPI試劑盒（欣博盛生物科技有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。熒光倒置顯微鏡（NIKONTP1020）；NU4750E

8、型CO2培養(yǎng)箱；DMR型多功能顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)；SW4T2F潔凈工作臺；KQ500B超聲波清洗器。1.21.2方法方法1.2.11.2.1實驗分組實驗分組取對數(shù)生長期的細胞接種于孔板中，于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，分別加入不同濃度（0.1、1、5、20gmL）的竹節(jié)參總提物培養(yǎng)12h，再加入H2O2（600moLL）繼續(xù)培養(yǎng)12h。模型組直接加入600moLLH2O2處理12h。(以下實驗細胞處理方法相同)1.2.21.

9、2.2MTTMTT法檢測細胞活力法檢測細胞活力收集細胞，制成5104mL細胞懸液，取96孔酶標板，每孔加入200L細胞懸液，處理后各孔同時加入20LMTT（5gL），37℃孵育4h，棄上清，每孔加入150LDMSO，混勻后于酶標儀上570nm測定光密度值。1.2.31.2.3SHSY5YSHSY5Y細胞的形態(tài)學變化細胞的形態(tài)學變化倒置顯微鏡觀察正常對照組、H2O2組、竹節(jié)參總提物各劑量組保護后的細胞形態(tài)。1.2.41.2.4酶生化法檢測

10、酶生化法檢測LDHLDH釋放量、釋放量、SODSOD活力和活力和MDAMDA含量含量收集細胞上清，參照LDH試劑盒檢測細胞上清LDH的活性。裂解細胞，參照SOD、MDA試劑盒檢測細胞SOD活力及MDA的含量。1.2.51.2.5細胞內活性氧熒光檢測細胞內活性氧熒光檢測參照活性氧檢測試劑盒進行處理，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。1.2.61.2.6流式細胞術檢測細胞凋亡率流式細胞術檢測細胞凋亡率消化細胞，參照度較H2O2組降低，且熒光強度隨著

11、總提物濃度的升高而降低。見圖2。2.62.6竹節(jié)參總提物對竹節(jié)參總提物對H2O2損傷的損傷的SHSY5YSHSY5Y神經細胞凋神經細胞凋亡的影響亡的影響正常對照組細胞凋亡率為3.2%，活細胞占96.2%；H2O2組的凋亡率為53.3%，活細胞占30.2%；竹節(jié)參總提物用藥組5gmL和20gmL的凋亡率分別下降至7.8%和3.3%，活細胞上升至65.0%和83.6%。A：正常對照組；B：H2O2組；C：H2O2PJE（0.1gmL）組；D

12、：H2O2PJE（1gmL）組；E：H2OPJE（5gmL）組；F：H2O2PJE（20gmL）組圖2竹節(jié)參總提物對H2O2損傷的SHSY5Y神經細胞內活性氧的影響3討論討論氧化應激是神經退行性疾病的發(fā)病機制之一[6]。研究表明，在神經退行性疾病中，腦內的氧化應激水平也隨之提高，神經細胞受到活性氧的攻擊后發(fā)生凋亡[7]。SHSY5Y細胞系是人神經母細胞瘤細胞，分化程度較低，且增殖較快，在藥理實驗中多采用H2O2誘導其凋亡作為神經退行性疾

13、病模型。本實驗給予竹節(jié)參總提物預保護12h，然后采用H2O2作為外源性自由基生成系統(tǒng)，作用于SHSY5Y細胞12h，模擬神經細胞氧化應激。從細胞形態(tài)上看，給予竹節(jié)參總提物預保護后，形態(tài)改變明顯減少。細胞活力顯著上升，細胞膜的完整性也有明顯的改善。自由基可以和細胞發(fā)生脂質過氧化反應產生MDA，SOD是清除氧自由基的首要物質，也是生物體抗氧化體系的重要組成部分。本研究結果顯示，竹節(jié)參總提物能有效降低MDA含量和升高SOD活力。參與氧化應激的

14、主要是過量的自由基，通過DCFADA探針檢測法，可以從熒光顯微鏡中直接觀察到細胞內氧自由基含量的高低，竹節(jié)參總提物可以降低由H2O2所致的細胞內ROS的含量。從而表明竹節(jié)參總提物可以有效地減弱氧化應激損傷。流式實驗結果更好地驗證了上述觀點，活性氧的升高會耗竭內源性氧化劑從而導致細胞凋亡，有研究表明，阻斷ROS的產生，就可以阻止布西拉明（該藥物通過促關節(jié)腔滑液細胞的凋亡來治療類風濕關節(jié)炎）的促凋亡作用[8]，竹節(jié)參總提物可以明顯減少細胞凋

15、亡程度，提高細胞的存活率。本研究結果充分顯示竹節(jié)參總提物對H2O2所致的細胞氧化應激損傷具有保護作用，但對其作用靶點還有待進一步研究。參考文獻：[1]KovacicPSomanathanR.Redoxprocessesinneurodegenerativediseaseinvolvingreactiveoxygenspecies[J].CurrNeuropharmacol201210(4):289302.[2]PoljsakBSuput

16、DMilisavI.AchievingtheBalancebetweenROSAntioxidants:WhentoUsetheSyntheticAntioxidants[J].Oxidativemedicinecellularlongevity20132013:956792.[3]左銳袁丁.竹節(jié)參化學成分和藥理活性研究進展[J].時珍國醫(yī)國藥200516(9):838839.[4]賈占紅趙暉.竹節(jié)參總皂苷對腦缺血大鼠神經細胞凋亡和即早

17、基因表達的影響[J].中國實驗方劑學201121(17):168172.[5]王洪武，李守超賀海波等.竹節(jié)參提取物對小鼠急性酒精性肝損傷的保護作用[J].基礎研究201217(9):961966.[6]鄧旭坤米雪蔡儉等.竹節(jié)參總皂苷的抗腫瘤作用和毒性研究[J].中南民族大學學報（自然科學版）201332(1):4749.[7]IdanFeldmanASchireraYPolyzoidouEetal.Davuide(NAP)asaprev