氧化應(yīng)激對SH-SY5Y細(xì)胞中鐵調(diào)節(jié)蛋白IRP2的調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是一種常見的多發(fā)于中老年人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其主要病理改變?yōu)楹谫|(zhì)多巴胺（dopamine，DA）能神經(jīng)元的變性死亡以及殘存神經(jīng)元內(nèi)路易小體的形成。目前，PD的發(fā)病機(jī)制仍不清楚。氧化應(yīng)激作為自由基在體內(nèi)產(chǎn)生的一種負(fù)面作用，被認(rèn)為是導(dǎo)致 PD的一個(gè)重要原因，其通過多種途徑引起黑質(zhì)DA能神經(jīng)元的死亡。神經(jīng)影像學(xué)檢查以及尸檢病理報(bào)告指出，PD病人早期鐵選擇性聚集在黑質(zhì)，殘存的DA能

2、神經(jīng)元內(nèi)鐵含量增高，表明鐵代謝調(diào)控異常是導(dǎo)致PD中DA能神經(jīng)元損傷的一個(gè)關(guān)鍵因素。細(xì)胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)的維持，依賴于胞漿中的鐵調(diào)節(jié)蛋白（iron regulatory proteins，IRPs），其通過與鐵代謝相關(guān)蛋白mRNA上的鐵反應(yīng)元件（iron regulatory elements，IRE）結(jié)合，調(diào)節(jié)這些蛋白的表達(dá)水平，從而維持細(xì)胞內(nèi)的鐵穩(wěn)態(tài)。IRPs分為IRP1和IRP2兩種形式，盡管IRP1和IRP2在機(jī)體廣泛表達(dá)，IRP1主要表

3、達(dá)在外周組織，而IRP2主要表達(dá)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)。IRP2-/-小鼠在6月齡時(shí)出現(xiàn)神經(jīng)退行性改變，黑質(zhì)、小腦、海馬和尾核和白質(zhì)有明顯的鐵沉積，而IRP1-/-小鼠不出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)的異常表現(xiàn)，說明IRP2是調(diào)控腦鐵代謝穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵蛋白。但是，目前關(guān)于神經(jīng)系統(tǒng)IRP2的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，與細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的關(guān)系，研究極少。對于該問題的闡明，將對了解 PD黑質(zhì)的鐵聚集機(jī)制和發(fā)病機(jī)制提供新的思路。
　　IRP2的蛋白表達(dá)調(diào)控途徑有多種，包括轉(zhuǎn)錄水平

4、、轉(zhuǎn)錄后水平、翻譯水平和翻譯后修飾水平，其中翻譯后蛋白修飾是維持其穩(wěn)定的主要途徑，而泛素化修飾在蛋白質(zhì)降解過程中發(fā)揮重要的作用。靶蛋白的泛素化需要特異的泛素連接酶（ubiquitin ligase，E3），E3通過識別和結(jié)合特異的靶蛋白序列特異性地調(diào)節(jié)靶蛋白的降解代謝，經(jīng)E3泛素化修飾的靶蛋白一般被26S蛋白酶體識別并降解。研究發(fā)現(xiàn)F-盒富含亮氨酸重復(fù)蛋白5（F-box and leucine rich repeat protein5，

5、FBXL5）是一種鐵和氧依賴的E3泛素連接酶，在鐵和氧充足時(shí)其活性和穩(wěn)定性增強(qiáng)，催化IRP2的泛素化降解。但是，在PD中IRP2的表達(dá)變化是否與FBXL5相關(guān)尚不清楚。針對這一問題，本實(shí)驗(yàn)在SH-SY5Y細(xì)胞上，應(yīng)用噻唑蘭（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）觀察細(xì)胞活力的變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧類物質(zhì)（reactive oxygen species，ROS）水平和線粒

6、體膜電位（mitochondrial membrane potential，ΔΨm）的改變，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測FBXL5和IRP2的mRNA表達(dá)水平，免疫印跡法檢測FBXL5和IRP2的蛋白表達(dá)水平，激光共聚焦顯微鏡技術(shù)檢測細(xì)胞攝鐵功能的變化，觀察不同的氧化應(yīng)激刺激，如H2O2、檸檬酸鐵胺（ferric ammonium citrate，F(xiàn)AC）和硝普鈉（sodium nitroprusside，SNP），對IRP2蛋白表達(dá)水平的影

7、響，并初步探討其機(jī)制。研究結(jié)果如下：
　　1. SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)不同濃度的H2O2處理24 hrs后，應(yīng)用MTT方法檢測細(xì)胞存活率，結(jié)果顯示細(xì)胞存活率隨H2O2濃度的升高而降低，與對照組相比，20、30、50、200、300、500和1000μmol/L H2O2處理組細(xì)胞存活率分別下降10.2%、12.9%、13.7%、15.3%、21.2%、33.6%和38.6%，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　2.200

8、μmol/L和300μmol/L H2O2處理SH-SY5Y細(xì)胞24 hrs后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平分別升高了52.2%和87.3%，與對照組相比，差別具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。細(xì)胞的ΔΨm分別降低了1.7%和8.2%，與對照組相比，300μmol/L H2O2處理組差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　3.200μmol/L和300μmol/L H2O2處理SH-SY5Y細(xì)胞24 hrs，F(xiàn)BXL5的蛋白表達(dá)水平分別增

9、高了20%和31%，IRP2的蛋白表達(dá)水平分別降低了44%和75%，與對照組相比，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而FBXL5和IRP2的mRNA水平無明顯變化（P＞0.05）。應(yīng)用泛素-蛋白酶體抑制劑MG132預(yù)孵育后，200μmol/L和300μmol/L H2O2處理組細(xì)胞的FBXL5蛋白水平無明顯變化，而IRP2的蛋白水平分別升高了49%和28%，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。應(yīng)用 si-FBXL5預(yù)孵育后，200μm

10、ol/L和300μmol/L H2O2處理組細(xì)胞24 hrs，F(xiàn)BXL5蛋白水平分別降低86%和101%，而IRP2的蛋白水平分別升高39%和26%，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　4.200μmol/L和300μmol/L H2O2處理SH-SY5Y細(xì)胞24 hrs，給予100μmol/L的 Fe2+灌流，應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞攝鐵能力的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間而增強(qiáng)，說明細(xì)胞對 Fe2+的攝取能力減

11、弱，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　5. SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)不同濃度的FAC處理24 hrs后，MTT結(jié)果顯示，10、30和50μg/mL FAC處理組細(xì)胞存活率無明顯變化，100、300、500和1000μg/mL處理組細(xì)胞存活率隨FAC濃度的升高而降低，與對照組相比，分別下降14.3%、26%、29.4%和38.5%，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。10μg/mL和100μg/mL FAC處理SH-SY5Y細(xì)胞

12、24 hrs后，細(xì)胞內(nèi)ROS含量分別升高63.3%和94.8%，與對照組相比，差別具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。細(xì)胞的ΔΨm分別降低了12%和27%，與對照組相比，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。細(xì)胞內(nèi)FBXL5的蛋白水平分別升高了21%和37%，而IRP2的蛋白水平分別降低了28%和45%，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　6. SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)不同濃度的SNP處理24 hrs后，MTT結(jié)果顯示，10、30

13、、50和100μmol/L處理組細(xì)胞存活率無明顯變化，300和500μmol/L組細(xì)胞存活率隨SNP濃度的升高而降低，與對照組相比，分別下降21.9%和42%，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。100μmol/L和300μmol/L SNP處理SH-SY5Y細(xì)胞24 hrs后，細(xì)胞內(nèi)ROS含量分別升高了58.6%和82.3%，與對照組相比，差別具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。細(xì)胞的ΔΨm分別降低了43%和60%，與對照組相比，差別

14、具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。細(xì)胞內(nèi)FBXL5的蛋白水平分別上升了29%和40%，IRP2的蛋白水平分別降低了13%和47%，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同的氧化應(yīng)激刺激，如 H2O2、FAC和 SNP，均可導(dǎo)致SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，線粒體膜電位下降，造成細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)，進(jìn)一步引起FBXL5蛋白表達(dá)水平的升高，而IRP2蛋白表達(dá)水平降低，最終導(dǎo)致細(xì)胞攝鐵能力的降低。而FBXL

15、5和IRP2的mRNA水平均未變化，說明IRP2蛋白水平的降低并非由轉(zhuǎn)錄水平的因素影響的。而泛素-蛋白酶體途徑的抑制劑 MG132處理后，F(xiàn)BXL5蛋白表達(dá)量不變，而IRP2蛋白表達(dá)量明顯升高，si-FBXL5處理后，F(xiàn)BXL5蛋白表達(dá)量顯著降低，而IRP2蛋白表達(dá)量明顯升高，說明MG132阻斷了IRP2泛素化降解過程，此過程是由FBXL5介導(dǎo)的。本研究表明，氧化應(yīng)激因素可以作用于泛素化修飾途徑，從而影響IRP2的蛋白表達(dá)水平，為進(jìn)一步