大腸桿菌好氧發(fā)酵生產(chǎn)蘋(píng)果酸的代謝工程研究.pdf

1、蘋(píng)果酸，又名2－羥基丁二酸，是生物體內(nèi)三羧酸循環(huán)的重要一員，其酸味持久柔和，是優(yōu)良的酸味劑，蘋(píng)果酸在醫(yī)藥、食品等多個(gè)行業(yè)中都有廣泛用途。蘋(píng)果酸的生產(chǎn)方法包括從植物中提取，酶轉(zhuǎn)化法，化學(xué)合成法及微生物發(fā)酵法，由于能源和環(huán)境的日益惡化，微生物發(fā)酵法越來(lái)越受重視。本文通過(guò)代謝工程的策略構(gòu)建了能夠利用甘油、葡萄糖為底物高效生產(chǎn)蘋(píng)果酸的大腸桿菌菌株。
　　本文對(duì)大腸桿菌利用甘油、葡萄糖為底物生產(chǎn)蘋(píng)果酸的代謝網(wǎng)絡(luò)模型進(jìn)行了系統(tǒng)分析，通過(guò)截?cái)嗵O(píng)

2、果酸消耗途徑，增強(qiáng)羧化通量，阻斷副產(chǎn)物積累途徑等策略構(gòu)建了一系列生產(chǎn)蘋(píng)果酸的菌株；并在好氧條件下分別以甘油和葡萄糖為碳源進(jìn)行發(fā)酵，考察菌株生產(chǎn)蘋(píng)果酸的能力。發(fā)酵結(jié)果顯示，不同碳源對(duì)蘋(píng)果酸的積累有影響。
　　首先在大腸桿菌E2中過(guò)表達(dá)了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc，得到菌株E21，以甘油為底物蘋(píng)果酸積累量從0.76提高到4.69 g/L，說(shuō)明乙醛酸途徑的增強(qiáng)有利于蘋(píng)果酸的積累。采用單敲除和組合敲除策略，敲除蘋(píng)果酸脫氫酶基因mdh

3、，mqo及蘋(píng)果酸酶基因maeA和maeB。其中表現(xiàn)優(yōu)異的菌株E23（E21，△maeA，△maeB）利用9.8 g/L甘油積累了5.14 g/L蘋(píng)果酸，蘋(píng)果酸得率為0.36 mol/mol甘油。說(shuō)明阻斷蘋(píng)果酸的消耗途徑對(duì)于蘋(píng)果酸的積累是有利的。
　　通過(guò)引入谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）的丙酮酸羧化酶基因pyc和產(chǎn)琥珀酸放線桿菌（Actinobacillus succinogenes）的pc

4、k基因，增強(qiáng)菌株的羧化途徑，但是在以甘油為底物進(jìn)行好氧發(fā)酵時(shí)，羧化途徑的增強(qiáng)并沒(méi)有進(jìn)一步提高蘋(píng)果酸的產(chǎn)量。
　　以葡萄糖為底物進(jìn)行好氧發(fā)酵，表現(xiàn)突出的菌株為雙敲除菌株E23（E21，△maeA，△maeB）和E21（pTrcpyc），蘋(píng)果酸得率分別為0.62 mol/mol和0.79 mol/mol葡萄糖。說(shuō)明解除蘋(píng)果酸的消耗途徑對(duì)于蘋(píng)果酸的積累是有利的，同時(shí)由于丙酮酸的濃度由于葡萄糖通過(guò)PTS系統(tǒng)運(yùn)輸而保持較高的水平，pyc基因