WISP-2基因在人腦星形細胞瘤中的表達、作用及機制研究.pdf

1、第一章 WISP-2基因在人腦星形細胞瘤中的表達研究
　　 目的：研究Wnt-1誘導分泌蛋白2(WISP-2)基因在人腦星形細胞瘤中的表達情況及其與人腦星形細胞瘤發(fā)生、發(fā)展的關系。
　　 方法：采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測47例人腦星形細胞腫瘤、10例正常腦組織中WISP-2的mRNA表達水平，并結(jié)合臨床資料分析WISP-2表達水平與星形細胞瘤臨床指標的相關性關系。
　　 結(jié)果：RT-PCR檢測結(jié)果

2、顯示正常腦組織中無WISP-2mRNA表達，在星形細胞瘤中相對表達量為0.677±0.445，與正常組比較差異有顯著性(t＝4.783,P＜0.01)。高級別組(Ⅲ,Ⅳ)與低級別組(Ⅰ,Ⅱ)WISP-2mRNA相對表達量分別為0.924±0.438、0.478±0.344，兩者比較差異有顯著性(t＝3.909,P＜0.01)，Spearman相關性分析顯示W(wǎng)ISP-2mRNA表達水平和腫瘤病理級別具有顯著性正相關關系(r＝0.448,P

3、＝0.002)。WISP-2mRNA的表達與年齡、性別、腫瘤部位無顯著性相關關系(均P0.05)，與腫瘤大小有顯著性關系(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：WISP-2mRNA在人腦星形細胞瘤中有表達，其表達水平與人腦星形細胞瘤的惡性程度密切相關；提示W(wǎng)ISP-2在人腦星形細胞瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。WISP-2基因有可能作為評價人腦星形細胞瘤惡性程度的指標之一。
　　 第二章 WISP-2蛋白在人腦星形細胞瘤

4、中的表達意義
　　 目的：研究WSIP-2蛋白在人腦星形細胞瘤中的表達情況及其與各臨床病理指標的關系。
　　 方法：采用免疫組織化學SP法檢測54例人腦星形細胞瘤和10例正常腦組織中的WSIP-2蛋白表達，分析其表達水平與患者各臨床病理指標之間的關系。
　　 結(jié)果：免疫組化檢測結(jié)果顯示正常腦組織細胞中無WISP-2蛋白陽性表達(0/10)。WISP-2蛋白在星形細胞瘤組織內(nèi)呈陽性表達，陽性率為64.8％(35/5

5、4)，與正常腦組織中表達比較有顯著性意義(P＜0.05)。高級別組(Ⅲ,Ⅳ)與低級別組(Ⅰ,Ⅱ)中WISP-2蛋白表達陽性率分別為80.8％(21/26)、50.0％(14/28)，兩者比較差異有顯著性(P＜0.05)。WISP-2蛋白的表達與年齡、性別、腫瘤部位無顯著性關系(均P＞0.05)，與腫瘤大小有顯著關系(P＜0.05)。通過Spearman相關分析表明，WISP-2蛋白表達水平隨著腫瘤的級別升高而增高(r＝0.370,P＝0

6、.006)，兩者呈正相關性關系。
　　 結(jié)論：WSIP-2蛋白在人腦星形細胞瘤中高表達，與人腦星形細胞瘤的病理分級有正相關性，有可能作為星形細胞瘤惡性程度的指標。
　　 第三章 WISP-2基因siRNA的構(gòu)建及有效靶點篩選
　　 目的：構(gòu)建沉默人WISP-2基因表達的siRNA序列并篩選出有效siRNA序列，為體外研究WISP-2的生物學功能提供材料。
　　 方法：通過RT-PCR檢測WISP-2mRN

7、A在U251細胞株的表達，設計5個靶向WISP-2的RNA干擾序列的小干擾RNA，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染U251細胞，RT-PCR及Westernblot篩選有效干擾序列，熒光倒置顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果，最終得到人WISP-2基因沉默的U251細胞株。
　　 結(jié)果：WISP-2mRNA在U251細胞株中表達，組5(WISP-2-289siRNA)沉默WISP-2表達后，RT-PCR及Westernblot方法檢測到WISP-2mRNA和蛋白

8、表達水平分別為0.113±0.111，(19.03±1.44)％，與其組1（空白對照組）、組2（陰性對照組）、組3(WISP-2-639siRNA)、組4(WISP-2-307siRNA)比較，差異有顯著性意義(P＜0.05)。熒光倒置顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率為(87.03±11.56)％。
　　 結(jié)論：篩選出合適的WISP-2siRNA干擾序列，為進一步體外研究WISP-2基因在U251細胞株中的作用提供基礎。
　　 第四章

9、 siRNA沉默WISP-2基因?qū)251細胞增殖、凋亡的影響
　　 目的：探討siRNA沉默WISP-2基因表達對U251細胞生物學特性的影響，以明確其在星形細胞瘤腫瘤形成過程中可能的作用及機制。
　　 方法：實驗分3組：空白對照組（未作任何干擾的U251細胞株）；陰性對照組（加入非特異性siRNA/Lipofectamine復合物的U251細胞株）；siRNA干擾組（為WISP-2-siRNA-289-脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的U

10、251細胞株）。通過MTT法、Transwell法、流式細胞儀PI染色法檢測人WISP-2基因表達對U251細胞的增殖、遷移、凋亡能力的影響，并檢測Bc1-2、Bax蛋白在細胞凋亡過程中的表達。
　　 結(jié)果：MTT檢測發(fā)現(xiàn)在相同的時間點，siRNA干擾組組的OD值明顯高于空白對照組和陰性對照組(P＜0.05)；檢測遷移能力實驗中siRNA干擾組腫瘤細胞的運動遷移能力明顯下降，穿過聚碳酸酯膜的細胞數(shù)量較對照組明顯下降，與對照組相比

11、有明顯區(qū)別(P＜0.05)；培養(yǎng)48h進行流式細胞儀檢測可見，siRNA干擾組平均凋亡率為(16.59±1.40)％，空白組平均凋亡率為(3.13±0.34)％，陰性組平均凋亡率為(3.42±0.48)％，siRNA干擾組與陰性對照組、空白對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。在檢測增殖、遷移、凋亡實驗中，陰性對照組和空白對照組無明顯差異(P0.05)。siRNA干擾組WISP-2蛋白表達水平為(18.67±1.40)％明顯低于空

12、白對照組(70.18±1.82)％和陰性對照組(69.41±1.77)％，且差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，兩對照組WISP-2蛋白表達水平比較差異無顯著意義(P＞0.05)，siRNA干擾組Bc1-2蛋白表達水平為(29.67±1.47)％，明顯低于空白對照組(49.51±1.71)％和陰性對照組(49.07±1.35)％，且差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，兩對照組Bc1-2蛋白表達水平比較差異無顯著意義(P＞0.05)。siRN

13、A干擾組Bax蛋白表達水平為(31.62±1.32)％，明顯低于空白對照組(23.98±1.47)％和陰性對照組(24.06±1.55)％，且差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，兩對照組Bax蛋白水平比較差異無顯著意義(P＞0.05)。Spearman相關性分析顯示，siRNA沉默WISP-2表達后，WISP-2蛋白的表達與Bc1-2蛋白的表達具有正相關性(r＝0.995,P＜0.05)，即前者表達越低，后者表達也越低；siRNA沉默WI

14、SP-2表達后，WISP-2蛋白的表達與Bax蛋白的表達具有負相關性(r＝－0.944,P＜0.05)，即前者表達越低，后者表達越高。
　　 結(jié)論：在U251細胞中，siRNA沉默WISP-2基因表達后，可抑制U251細胞的增殖、侵襲能力，增加U251細胞凋亡。并提示通過抑制WISP-2蛋白表達后，下調(diào)Bc1-2/Bax蛋白表達的比值來誘導U251細胞凋亡。
　　 第五章 WISP-2基因沉默增強U251細胞對VP16的

15、敏感性研究
　　 目的：探討聯(lián)合應用WISP-2siRNA和足葉乙甙(VP16)對U251細胞藥物敏感性的影響并探討其作用機制。
　　 方法：應用轉(zhuǎn)染試劑LipofectaminTM2000將WISP-2siRNA轉(zhuǎn)入U251細胞，同時加入VP16聯(lián)合培養(yǎng)，48h后予MTT法檢測U251細胞增殖、流式細胞儀檢測U251細胞凋亡變化。
　　 結(jié)果：足葉乙甙(VP16)在濃度為1μg/mL就可以表現(xiàn)出對U251細胞的

16、抑制作用，U251細胞隨著藥物作用時間的延長和藥物濃度的增加而明顯抑制，具有明顯的量效和時效依賴性。MTT法顯示空白對照組、陰性對照組、siRNA干擾組、VP16組和siRNA干擾＋VP16組OD值分別為0.257±0.011、0.252±0.015、0.166±0.011、0.155±0.012、0.076±0.014，siRNA干擾組和VP16組細胞生長速度較空白對照組和陰性對照組顯著降低(P＜0.05)，siRNA干擾＋VP16組

17、生長速度較siRNA干擾組和VP16組顯著降低(P＜0.05)，空白對照組與陰性對照組比較無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。聯(lián)合應用WISP-2 siRNA和足葉乙甙(VP16)能明顯降低U251細胞增殖能力，WISP-2基因沉默能增加U251細胞對VP16增殖抑制的敏感性。流式細胞儀檢測細胞凋亡結(jié)果顯示空白組平均凋亡率為(3.06±0.39)％，陰性組平均凋亡率為(3.28±0.57)％，siRNA干擾組平均凋亡率為(15.72±1.55

18、)％，VP16干預組平均凋亡率為(14.76±1.41)％，siRNA干擾＋VP16組平均凋亡率為(33.09±2.13)％，統(tǒng)計分析結(jié)果顯示siRNA干擾組和VP16組與陰性對照組、空白對照組比較凋亡增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，siRNA干擾＋VP16組細胞凋亡率較siRNA干擾組和VP16組顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，陰性對照組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＝0.848)。
　　 結(jié)論：聯(lián)合