蘋果褪綠葉斑病毒的組織定位研究.pdf

1、蘋果病毒病嚴(yán)重影響了蘋果的產(chǎn)量和質(zhì)量。蘋果褪綠葉斑病毒(Apple chlorotic leafspot virus，ACLSV)是危害蘋果生產(chǎn)的最主要的潛隱病毒之一，可使蘋果葉片褪綠黃化，果實(shí)畸形，品質(zhì)惡劣，甚至?xí)斐芍仓晁劳?。建立病毒快速檢測(cè)技術(shù)并分析病毒分布特點(diǎn)是控制病毒危害、了解病毒致病機(jī)理的重要環(huán)節(jié)，本實(shí)驗(yàn)主要利用分子雜交技術(shù)對(duì)病毒進(jìn)行快速檢測(cè)，并進(jìn)一步利用原位反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)對(duì)病毒在蘋果葉片組織中進(jìn)行定位。
　　本研究

2、首先探索建立利用分子雜交技術(shù)檢測(cè)蘋果褪綠葉斑病毒的技術(shù)體系。利用CTAB法提取感病蘋果葉片總RNA，以總RNA為模板，利用特異性引物，擴(kuò)增出了預(yù)期片段，經(jīng)克隆、測(cè)序證明其為蘋果褪綠葉斑病毒的特異性片段。以帶有特異片段的質(zhì)粒為模板，利用PCR技術(shù)制備出地高辛標(biāo)記的的cDNA探針。建立了利用cDNA探針檢測(cè)蘋果褪綠葉斑病毒的技術(shù)體系。以質(zhì)粒為模板可高效制備大量探針，地高辛標(biāo)記探針為非放射性標(biāo)記探針，安全性較好，靈敏度較高，具有重要的應(yīng)用價(jià)值

3、。探針經(jīng)分子雜交檢測(cè)為有效探針，可用于原位PCR反應(yīng)中的組織定位。
　　將蘋果葉片組織切片后固定于正電荷防脫載玻片上，然后進(jìn)行原位反轉(zhuǎn)錄 PCR反應(yīng)，再加入已制備好的有效的地高辛標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交反應(yīng)，最后將蘋果葉片組織切片在倒置顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示:感病的蘋果葉片葉肉細(xì)胞的柵欄組織中呈現(xiàn)出大量的藍(lán)紫色斑點(diǎn)，海綿組織中個(gè)別部位呈淺藍(lán)紫色，陰性對(duì)照未出現(xiàn)顯色反應(yīng)。推測(cè)海綿組織中病毒含量較低，病毒主要集中于柵欄組織。大量的葉綠體存在