2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述:
  第一部分 miRNA參與百草枯和MPTP致神經(jīng)細(xì)胞損害的作用研究
  目的:探討百草枯(PQ)、1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)致小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(Neuro-2a)損害時(shí)microRNA(miRNA)表達(dá)譜的變化情況,并比較這兩種神經(jīng)毒物所致miRNA表達(dá)譜改變模式。
  方法:(1)0、100、300μM PQ分別處理Neuro-2a細(xì)胞12、24、

2、48h,Hoechst-33258染料法(n=5)和Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞儀(n=3)測定細(xì)胞凋亡;0、300μM MPTP處理Neuro-2a細(xì)胞48h(n=3),Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡;(2)0、300μM PQ和300μM MPTP處理Neuro-2a細(xì)胞48h(n=3)后,進(jìn)行miRNA芯片檢測,分析miRNA表達(dá)譜的變化,并通過火山圖(Volcano Plot)過濾,確定差

3、異表達(dá)的miRNA(差異倍數(shù)(FC)≥1.5,p<0.05);(3)挑選出6個(gè)差異表達(dá)的miRNAs(miR-17-5p、miR-93-5p、miR-210-3p、miR-374-5p、miR-378-3p、miR-503-5p),用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)驗(yàn)證其表達(dá)水平;(4)用Microcosm、Targetscan和Miranda預(yù)測miRNA潛在靶基因;對特異的miRNA下游靶基因進(jìn)行基因本體(GO)分析和KEGG通

4、路分析。
  結(jié)果:(1)PQ可誘導(dǎo)Neuro-2a細(xì)胞凋亡和死亡,且存在時(shí)間-劑量效應(yīng)和濃度-劑量效應(yīng),時(shí)間和濃度之間存在交互作用;MPTP也可誘導(dǎo)Neuro-2a細(xì)胞凋亡和死亡;(2)300μM PQ和300μM MPTP處理細(xì)胞48h,均可引起miRNA表達(dá)譜的改變;與對照組比較,PQ組60個(gè)miRNAs表達(dá)上調(diào),228個(gè)表達(dá)下調(diào);MPTP組506個(gè)表達(dá)上調(diào),70個(gè)表達(dá)下調(diào);(3)qRT-PCR驗(yàn)證miRNAs的表達(dá)水平的結(jié)

5、果表明:與對照組比較,PQ組miR-374-5p和miR-503-5p表達(dá)下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05);MPTP組miR-93-5p表達(dá)上調(diào),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05);與PQ組比較,MPTP組miR-17-5p和miR-378-3p表達(dá)上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05),miR-93-5p和miR-210-3p表達(dá)上調(diào),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05);其結(jié)果與芯片結(jié)果大體一致。(4)聯(lián)合應(yīng)用靶基因預(yù)測程序預(yù)測到3

6、62個(gè)共同靶基因,基因本體(GO)分析結(jié)果表明:miR-17-5p和miR-93-5p共同參與DNA依賴的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA代謝過程和分子功能的調(diào)節(jié),miR-17-5p還參與細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián)、嘌呤核苷酸的結(jié)合過程,miR-93-5p還參與磷代謝、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的活性過程;KEGG pathway分析結(jié)果表明:miR-17-5p和miR-93-5p共同參與內(nèi)吞作用、細(xì)胞周期通路,miR-17-5p還參與MAPK信號通路、泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解,mi

7、R-93-5p還參與膀胱癌、TGF-β信號通路、p53信號通路??傊@些結(jié)果共同提示miRNA可能參與PQ誘導(dǎo)和MPTP誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞退行性病變過程。
  結(jié)論:PQ和MPTP致神經(jīng)細(xì)胞損害時(shí)均出現(xiàn)miRNA表達(dá)譜的特征性改變,miRNA可能參與PQ和MPTP致神經(jīng)細(xì)胞退行性病變的分子機(jī)制。
  第二部分 反式轉(zhuǎn)錄因子Nrf2參與百草枯和MPTP致神經(jīng)細(xì)胞損害的作用
  目的:建立PQ或MPTP染毒Nrf2(+/+)

8、和Nrf2(-/-)ICR小鼠PD模型,進(jìn)一步探討Nrf2參與百草枯和MPTP致神經(jīng)細(xì)胞損害的作用。
  方法:(1)5、10mg/kg PQ和30mg/kg MPTP染毒Nrf2(+/+)和Nrf2(-/-)小鼠;(2)HE染色法檢測中腦黑質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變(n=3),每組三片;(3)酪氨酸羥化酶TH免疫組化染色法檢測中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量變化情況(n=3),每組三片;(4)原位缺口末端標(biāo)記TUNEL檢測中腦黑質(zhì)細(xì)胞凋亡情況(

9、n=3),每組三片;(5)Nrf2免疫組化染色法檢測中腦黑質(zhì)Nrf2蛋白表達(dá)情況(n=3),每組三片。
  結(jié)果:(1)PQ、MPTP染毒小鼠后出現(xiàn)類PD樣行為異常,Nrf2(-/-)小鼠表現(xiàn)更為明顯。(2)與生理鹽水對照組相比,30mg/kg MPTP染毒Nrf2(+/+)和Nrf2(-/-)小鼠神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞核固縮、碎裂、呈藍(lán)黑色,未見其他明顯變化;5、10mg/kg PQ染毒Nrf2(+/+)和Nrf2(-/-)小鼠

10、細(xì)胞同樣出現(xiàn)明顯的細(xì)胞核固縮、碎裂,呈藍(lán)黑色,未見其他明顯變化。(3)與生理鹽水對照組比較,MPTP染毒Nrf2(+/+)和Nrf2(-/-)小鼠的中腦黑質(zhì)TH蛋白免疫反應(yīng)陽性的DA神經(jīng)元數(shù)量減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。5mg/kg PQ染毒Nrf2(+/+)和Nrf2(-/-)小鼠TH蛋白免疫反應(yīng)陽性的DA神經(jīng)元未見明顯變化,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。10mg/kg PQ染毒Nrf2(+/+)和Nrf2(-/-)小

11、鼠TH蛋白免疫反應(yīng)陽性的DA神經(jīng)元數(shù)量減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。(4)與生理鹽水對照組相比,30mg/kg MPTP染毒后,Nrf2(+/+)ICR和Nrf2(-/-)小鼠中腦黒質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞均見凋亡;雖然5mg/kg PQ染毒后,Nrf2(+/+)ICR和Nrf2(-/-)小鼠中腦黒質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞未見明顯凋亡,但10mg/kg PQ染毒后,Nrf2(+/+)ICR和Nrf2(-/-)小鼠中腦黒質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞均見凋亡。(5)生理鹽水處

12、理Nrf2(+/+)和Nrf2(-/-)小鼠中腦黑質(zhì),細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞凋亡率未見差異,TH蛋白免疫反應(yīng)陽性的DA神經(jīng)元數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05);5mg/kg PQ染毒Nrf2(+/+)和Nrf2(-/-)小鼠中腦黑質(zhì)細(xì)胞核出現(xiàn)核固縮、碎裂、呈藍(lán)黑色,細(xì)胞均未見凋亡;TH蛋白免疫反應(yīng)陽性的DA神經(jīng)元蛋白數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05);10mg/kg PQ染毒Nrf2(+/+)和Nrf2(-/-)小鼠中腦黑質(zhì)細(xì)胞核出現(xiàn)核固縮

13、、碎裂、呈藍(lán)黑色,可見較明顯的細(xì)胞凋亡;10mg/kg PQ染毒Nrf2(-/-)小鼠TH蛋白免疫反應(yīng)陽性的DA神經(jīng)元數(shù)量與Nrf2(+/+)小鼠相比有所減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05);30mg/kg MPTP染毒Nrf2(+/+)和Nrf2(-/-)小鼠中腦黑質(zhì)均出現(xiàn)核固縮、碎裂、呈藍(lán)黑色,可見較明顯的細(xì)胞凋亡;Nrf2(-/-)小鼠比Nrf2(+/+)小鼠TH蛋白免疫反應(yīng)陽性的DA神經(jīng)元表達(dá)上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.0

14、5)。(6)生理鹽水處理Nrf2(-/-)小鼠與Nrf2(+/+)小鼠后,與Nrf2(+/+)小鼠對比,Nrf2(-/-)小鼠Nrf2表達(dá)量明顯降低,基本上不表達(dá)。(7)與生理鹽水Nrf2(+/+)ICR小鼠組比較,30mg/kg MPTP染毒組Nrf2蛋白表達(dá)下降;5mg/kg PQ染毒組也下降,但10mg/kg PQ染毒組有所增加。
  結(jié)論:成功建立PQ或MPTP染毒Nrf2(+/+)和Nrf2(-/-)小鼠PD模型;Nrf

15、2在PQ誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性中起神經(jīng)保護(hù)作用。
  第三部分 反式轉(zhuǎn)錄因子Nrf2在百草枯、MPTP致小鼠中腦黑質(zhì)microRNA表達(dá)改變中的作用
  目的:探討百草枯(PQ)、1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)致小鼠中腦黒質(zhì)損害時(shí)microRNA(miRNA)表達(dá)譜的變化情況,并比較這兩種神經(jīng)毒物所致miRNA表達(dá)譜改變模式;應(yīng)用Nrf2基因敲除小鼠探討反式轉(zhuǎn)錄因子Nrf2在百草枯、MPTP致小鼠中腦黑質(zhì)m

16、icroRNA表達(dá)改變中的可能作用。
  方法:(1)生理鹽水,5、10mg/kg PQ和30mg/kg MPTP染毒Nrf2(+/+)和Nrf2(-/-)小鼠(n=3);(2)生理鹽水,5、10mg/kg PQ和30mg/kg MPTP染毒Nrf2(+/+)和Nrf2(-/-)小鼠后,取中腦黒質(zhì)進(jìn)行miRNA(n=3)和mRNA(n=3)芯片檢測,分析miRNA和mRNA表達(dá)譜的變化,并通過火山圖(Volcano Plot)過濾

17、,確定差異表達(dá)的miRNA(差異倍數(shù)(FC)≥1.5且p<0.05),mRNA(差異倍數(shù)(FC)≥2且p<0.05);(3)用鎖定核苷酸原位雜交(LNA-ISH)和qRT-PCR驗(yàn)證驗(yàn)證miRNA-380-3p表達(dá)水平(n=3);(4)用Microcosm、Targetscan和Miranda預(yù)測miRNA-380-3p潛在靶基因,(5)預(yù)測到的潛在靶基因結(jié)果與mRNA芯片檢測結(jié)果比對分析,確認(rèn)潛在的可能下游靶基因。
  結(jié)果:(

18、1)Nrf2依賴效應(yīng)(非依賴于MPTP、PQ處理):miR-128、miR-7a、miR-669c、miR-298、miR-543、miR-770-5p、miR-669b*、miR-544-5p與Nrf2相關(guān)。(2)PQ或MPTP處理Nrf2(+/+)ICR小鼠中腦黒質(zhì)miRNA表達(dá)譜出現(xiàn)改變,miR-140和miR-380-3p可能參與PQ或MPTP引起的神經(jīng)毒性。(3)PQ或MPTP處理Nrf2(-/-)ICR小鼠miR-135b均

19、出現(xiàn)改變,不同劑量PQ處理Nrf2(-/-)ICR小鼠后miR-142-5p和miR-451均出現(xiàn)改變。(4)MPTP依賴效應(yīng)(非依賴于Nrf2):MPTP可引起miR-674-3p、miR-133b、miR-135b、miR-380-3p的改變。(5)低劑量PQ依賴效應(yīng)(非依賴于Nrf2):5mg/Kg PQ可引起miR-140表達(dá)的改變。(6)高劑量PQ依賴效應(yīng)(非依賴于Nrf2):未見相關(guān)miRNAs改變。(7)Nrf2-MPTP

20、相互作用的效應(yīng)(依賴于Nrf2和MPTP):miR-543、miR-379、miR-376c*、miR-380-3p、miR-467g、miR-669c*、miR-1902、let-7d*、miR-669f-3p、miR-351、miR-615-3p、miR-138-1*、miR-378/miR-378b、miR-99b*、miR-34b-3p。(8)Nrf2-低劑量PQ相互作用的效應(yīng)(依賴于Nrf2和低劑量PQ):miR-31、miR

21、-376c、let-7i*、miR-669b*、miR-377、miR-382、miR-338-5p、miR-135a、miR-344、miR-219-3p、miR-700*、miR-15b、miR-3099、miR-301a。(9)Nrf2-高劑量PQ相互作用的效應(yīng)(依賴于Nrf2和高劑量PQ):miR-495*、miR-154*、let-7b、miR-1983、miR-26a。(11)不同處理后共同差異表達(dá)的miRNAs有miR-3

22、76c、miR-154*、miR-377。(12)鎖定核苷酸原位雜交驗(yàn)證PQ或MPTP處理Nrf2(+/+)ICR和Nrf2(-/-)ICR小鼠后miR-380-3p表達(dá)情況,結(jié)果與表達(dá)譜一致。同樣qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果也與表達(dá)譜一致。(13)靶基因預(yù)測結(jié)果與mRNA表達(dá)譜結(jié)果共同提示Sp3mRNA可能是miRNA-380-3p的下游靶基因。miR-128、miR-7a、miR-669c、miR-298、miR-543、miR-770-

23、5p、miR-669b*、miR-544-5p與Nrf2相關(guān)。
  結(jié)論:PQ、MPTP體內(nèi)暴露可改變miRNA表達(dá)譜,這可能是PQ、MPTP神經(jīng)毒性作用機(jī)制之一,兩者引起的miRNA表達(dá)譜改變既有差異也有相關(guān);MPTP可能是通過其與反式作用因子Nrf2之間相互作用引起中腦黒質(zhì)miRNA表達(dá)譜改變,其中miR-380-3p/Sp3mRNA的途徑改變是其中結(jié)果之一,這很可能是MPTP誘導(dǎo)神經(jīng)毒性的機(jī)制之一;PQ可能是通過其與反式作用

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