蛇鯔（Saurida elongata）消化蛋白酶的研究.pdf

1、蛇鯔作為一種肉食性魚類，其消化道中蛋白酶的含量非常豐富。本論文采用生化方法和電泳技術(shù)對(duì)蛇鯔消化蛋白酶進(jìn)行了研究，首先對(duì)胃，腸中蛋白酶的性質(zhì)做了的初步研究，然后對(duì)其主要蛋白酶進(jìn)行了純化和理化性質(zhì)的研究，最后對(duì)消化蛋白酶的應(yīng)用做了初步探討。研究結(jié)果如下： 首先對(duì)蛇鯔消化道蛋白酶的性質(zhì)進(jìn)行了初步的研究。分別研究了pH值、溫度、抑制劑等因素對(duì)蛋白酶活性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在蛇鯔消化道中主要存在兩種類型的蛋白酶，一類是胃酸性蛋白酶，一類

2、是腸堿性蛋白酶，其最適pH值分別為2.0和10.0，最適溫度分別為40℃～45℃和50℃。通過溫度對(duì)酶活性的影響實(shí)驗(yàn)，兩種類型的蛋白酶都具有較高的熱穩(wěn)定性，并且較高的溫度(50℃)對(duì)腸蛋白酶有一定的激活作用。PMSF和PepstatinA能完全抑制胃中蛋白酶的活性，PCMB也能部分的抑制其活性，而EDTA和Trypsin inhibitor對(duì)其沒有影響； EDTA、PepstatinA、PCMB對(duì)蛇鯔腸蛋白酶活性基本上沒有影響，PMSF

3、和Trypsin Inhibitor則可以強(qiáng)烈的抑制其活性。通過蛋白酶譜分析，在胃中存在兩種蛋白酶的同工酶，分子量較為接近；腸中存在四種蛋白酶的同工酶。 蛇鯔胃蛋白酶粗酶液經(jīng)硫酸銨沉淀，Hitrap<'TM> Q FF離子交換層析，Sephadex G-100凝膠過濾層析，得到其純品，純化倍數(shù)為37.8倍，回收率為30.5％。經(jīng)SDS-PAGE顯示為單一譜帶，酶的亞基分子量為37.7kDa；測(cè)得其最適溫度為45℃，最適pH值為2

4、.2；酶的熱穩(wěn)定性良好，在40℃及以下溫度處理3h酶活沒有任何變化；酶在pH 1～10以下都比較穩(wěn)定，在強(qiáng)堿性條件下不穩(wěn)定；以酪蛋白為底物測(cè)得酶的Km值和Vmax值分別為2.25g/L和8.772μg/min：Ca<'2+>，Mn<'2+>、Mg<'2+>、Ba<'2+>對(duì)酶活性影響不大，Hg<'2+>對(duì)酶有較弱的抑制作用，Zn<'2+>、Cu<'2+>、Fe<'3+>對(duì)酶的抑制作用較強(qiáng)；EDTA和Trypsin inhibitor對(duì)酶

5、沒有明顯的抑制作用，PMSF和Pepstatin A能完全抑制其活性，PCMB和2，3-丁二酮對(duì)酶活性也有一定的抑制作用，其它試劑如2-ME、BrAc和TNBS作用酶時(shí)，對(duì)酶活基本上沒有影響。 蛇鯔腸蛋白酶粗酶液經(jīng)CCl<,4>脫脂，Sephadex G-100凝膠過濾層析和Hitrap<'TM>Q FF離子交換層析，得到其純品，純化倍數(shù)為5.87倍，回收率為11.58％。經(jīng)SDS-PAGE顯示為單一譜帶，酶的亞基分子量為23.

6、3kDa；測(cè)得其最適溫度為50℃，最適pH值為10.0；酶的熱穩(wěn)定性良好，在40℃及以下溫度處理3h酶活沒有任何變化；酶在pH5～11的范圍內(nèi)比較穩(wěn)定，在酸性和強(qiáng)堿性條件下不穩(wěn)定；以酪蛋白為底物測(cè)得酶的Km值和Vma)(值分別為3.32 g/L和31.75μg/min： Ca<'2+>、Mn<'2+>對(duì)酶活影響不大，F(xiàn)e<'3+>、Hg<'2+>、Cu<'2+>對(duì)酶有很強(qiáng)的抑制作用；PMSF、 Trypsin inhibitor和NBS

7、能完全抑制其活性，PCMB和Pepstatin A對(duì)其沒有明顯的抑制作用。以蛇鯔消化蛋白酶提取液為原料對(duì)蛇鯔肌肉進(jìn)行了水解實(shí)驗(yàn)。通過不同溫度下的水解實(shí)驗(yàn)表明，蛇鯔胃蛋白酶提取液和腸蛋白酶提取液水解蛇鯔肌肉的最佳溫度分別為40℃和50℃；通過與幾種商品蛋白酶進(jìn)行比較，蛇鯔胃蛋白酶提取液的水解效果一般，腸蛋白酶提取液的水解效果較好，是其它幾種酶的3～5倍：一定濃度的Na<'+>(0.1mol/L)能夠促進(jìn)蛇鯔消化蛋白酶的水解作用，K<'+>