多巴胺D1受體經(jīng)cAMP-PKA途徑對(duì)延髓面神經(jīng)后核內(nèi)側(cè)區(qū)吸氣神經(jīng)元-雙相呼氣神經(jīng)元放電活動(dòng)調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、基本節(jié)律性呼吸是維持哺乳動(dòng)物生命活動(dòng)的基本條件，基本呼吸節(jié)律產(chǎn)生的部位位于低位腦干的延髓。但迄今基本節(jié)律性呼吸發(fā)生及其調(diào)控機(jī)制仍未清楚；臨床日常用藥如運(yùn)用嗎啡類藥物鎮(zhèn)痛時(shí)會(huì)引起呼吸功能的異常；另一方面在臨床工作中很多疾病如各種中樞性呼吸衰竭、中樞性呼吸節(jié)律紊亂等很常見，也是引起病人死亡的常見原因之一。因此闡明呼吸節(jié)律發(fā)生的確切部位揭示其發(fā)生與調(diào)控機(jī)制無疑是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域重要課題之一；研究呼吸節(jié)律闡明基本生命現(xiàn)象的本質(zhì)不僅在理論上有著重要的

2、意義，而且對(duì)于指導(dǎo)臨床工作也具有重要的應(yīng)用價(jià)值。 為更好地研究呼吸節(jié)律，前人建立了新生大鼠離體延髓-脊髓標(biāo)本模型、延髓腦片標(biāo)本、pre-BotC“島”，它們是研究呼吸節(jié)律的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)機(jī)制良好的體外標(biāo)本。正是借助這些標(biāo)本，國內(nèi)外的學(xué)者對(duì)呼吸中樞的確切發(fā)生部位又做了大量的研究工作。目前主要有以下幾種觀點(diǎn)：1.延髓面神經(jīng)后核內(nèi)側(cè)區(qū)（the medial area of nucleus retrofacialis，mNRF）1986年我

3、室吳中海等提出mNRF是節(jié)律性呼吸產(chǎn)生的部位。mNRF包括面神經(jīng)后核內(nèi)側(cè)、網(wǎng)狀小細(xì)胞核腹外側(cè)、網(wǎng)狀巨細(xì)胞核背外側(cè)和外側(cè)網(wǎng)狀核內(nèi)側(cè)部分。2.pre-Botzinger復(fù)合體（pre-Botzinger complex，pre-BotC）1991年Smith等人的實(shí)驗(yàn)表明，在延髓吻端的一個(gè)部位對(duì)呼吸節(jié)律的發(fā)生極為重要，這個(gè)部位稱為pre-BotC；在該P(yáng)re-Botzinger復(fù)合體內(nèi)存在著一類電壓依賴性的、能夠產(chǎn)生節(jié)律性發(fā)放活動(dòng)的神經(jīng)元，

4、稱之為起步神經(jīng)元（Pace-maker neurons）；它對(duì)于產(chǎn)生節(jié)律性的呼吸活動(dòng)可能具有重要的意義。3.延髓頭腹外側(cè)區(qū)（the rostral ventrolateral medulla，RVLM）Onimaru等學(xué)者認(rèn)為可能RVLM是產(chǎn)生基本呼吸節(jié)律的關(guān)鍵部位。4.面神經(jīng)核周圍區(qū)（the vicinties of nucleus facialis，VFN）VFN包括面神經(jīng)后核、斜方體后核、pre-BotC。這四種定位的區(qū)域全部位于

5、延髓頭腹外側(cè)區(qū)，相互之間不完全相同，但有重疊。對(duì)于呼吸節(jié)律產(chǎn)生機(jī)制的認(rèn)識(shí)上目前主要存在兩種學(xué)說，即起步細(xì)胞學(xué)說（pacemaker neuron hypothesis）、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)學(xué)說（neurons network hypothesis）起步細(xì)胞學(xué)說認(rèn)為在延髓存在具有“起步”性質(zhì)的呼吸神經(jīng)元，它們表現(xiàn)有內(nèi)在的節(jié)律性活動(dòng)，這種活動(dòng)影響和決定了其它呼吸相關(guān)神經(jīng)元的活動(dòng)。我室在整體及新生鼠離體延髓腦薄片標(biāo)本的mNRF記錄到具有“起步”特征的呼

6、氣.吸氣跨時(shí)相神經(jīng)元（Expiratory-Inspiratory phase spanning neuron，E-I PS），這類神經(jīng)元放電開始于吸氣前（呼氣相的中、晚期），以頻率遞增的形式發(fā)放至吸氣開始，然后以恒頻的形式持續(xù)，最后與吸氣性放電同步結(jié)束。這類放電總是先于吸氣放電的神經(jīng)元可能就是“起步神經(jīng)元”（Pacemaker neuron）。神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)學(xué)說是以Richter等為代表，該學(xué)說認(rèn)為由呼吸節(jié)律發(fā)生器（RRG）和吸氣形式發(fā)生器

7、（IPG）組成呼吸神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)，呼吸節(jié)律的產(chǎn)生依賴于延髓內(nèi)呼吸神經(jīng)元之間復(fù)雜的相互聯(lián)系和相互作用。 諸多的神經(jīng)遞質(zhì)、調(diào)質(zhì)控制呼吸網(wǎng)絡(luò)的活動(dòng)。多巴胺（dopamine，DA）是一種小分子神經(jīng)遞質(zhì)，屬于兒茶酚胺類。在紋狀體、延髓、大腦皮層等部位有大量的多巴胺受體分布。多巴胺參與呼吸活動(dòng)、藥物成癮、痛覺以及缺血再灌注損傷等的調(diào)節(jié)。依據(jù)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的差異和氨基酸序列的差異，DA受體可以分為多巴胺D1、D2、D3、D4、D5五種受體，

8、它們都是G-蛋白耦聯(lián)受體。D1、D5受體通過Gs蛋白與腺苷酸環(huán)化酶（adenylate cyclase，AC）正偶聯(lián)，使AC的活力增加，使細(xì)胞內(nèi)的cAMP水平升高，進(jìn)而磷酸化效應(yīng)蛋白，產(chǎn)生各種生理病理效應(yīng)；多巴胺D2、D3、D4與Gi蛋白與AC負(fù)相關(guān)，從而抑制AC的活力，降低cAMP水平，以及提高磷脂酰肌醇代謝等，產(chǎn)生一系列的生理學(xué)效應(yīng)。 大量的研究表明激活或抑制多巴胺及其D1受體會(huì)影響cAMP的水平。Cheng L等人在負(fù)鼠腎

9、細(xì)胞的研究表明激活的多巴胺D1受體可激活細(xì)胞內(nèi)腺苷酸環(huán)化酶使cAMP出現(xiàn)劑量依賴性的增加，并且在磷酸二酯酶抑制劑3-異丁基-1-甲基黃嘌呤存在的條件下，還會(huì)引起cAMP的顯著增加；且這種作用可被D1受體阻斷劑阻斷。利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)Smith DO等發(fā)現(xiàn)小雞胚胎脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元表達(dá)多巴胺D1受體，將神經(jīng)元用100 microM多巴胺撫育后，神經(jīng)元內(nèi)的cAMP水平將會(huì)增加33%。對(duì)家兔動(dòng)脈血中cAMP含量進(jìn)行測試的結(jié)果表明，多巴胺D

10、1受體激動(dòng)劑非諾多巴可以引起腎、肺臟、腸系膜、股動(dòng)脈cAMP出現(xiàn)劑量依賴性增加，多巴胺D1受體特異性拮抗劑SCH-23390可以顯著地阻斷這種效應(yīng)。 在離體腦片上多巴胺D1受體對(duì)呼吸基本節(jié)律性發(fā)生和調(diào)節(jié)有什么樣的作用，通過什么樣的途徑起作用的，這些問題還不是很清楚，為了解決這些問題設(shè)計(jì)了本課題。旨在利用包含舌下神經(jīng)根和mNRF的離體延髓腦薄片：①探討多巴胺D1受體對(duì)舌下神經(jīng)根呼吸節(jié)律性放電活動(dòng)的影響；②觀察多巴胺D1對(duì)舌下神經(jīng)根

11、及吸氣神經(jīng)元/雙相呼氣神經(jīng)元放電活動(dòng)的調(diào)制作用；③研究cAMP變化對(duì)呼吸神經(jīng)元基本放電活動(dòng)的影響。④觀察pre-BotC“島”多巴胺D1受體的表達(dá)情況；⑤探討多巴胺D1受體調(diào)控基本呼吸節(jié)律的可能機(jī)制。 1、多巴胺D1受體對(duì)舌下神經(jīng)根呼吸節(jié)律性放電活動(dòng)（the respiratory rhythmic discharge activity，RRDA）的影響 1.1 不同濃度A68930組對(duì)RRDA影響 1.2 不同

12、濃度SCH-23390組對(duì)RRDA影響 1.3 A68930組與A68930+SCH-23390組 給予5μmol/L A68930灌流腦片，RC、TE顯著縮短（P<0.001）、IA顯著增大（P<0.001）；而且A68930的作用可以被2μmol/L SCH-23390部分逆轉(zhuǎn)。 2、多巴胺D1受體對(duì)mNRF區(qū)吸氣神經(jīng)元/雙相呼氣神經(jīng)元放電活動(dòng)的調(diào)控 2.1 多巴胺D1受體對(duì)吸氣神經(jīng)元的影響

13、2.2 多巴胺D1受體對(duì)雙相呼氣神經(jīng)元的作用 3、cAMP在多巴胺D1受體對(duì)面神經(jīng)后核內(nèi)側(cè)區(qū)吸氣神經(jīng)元/雙相呼氣神經(jīng)元放電活動(dòng)調(diào)控中的作用 3.1 IBMX、forskolin與clonidine、Rp-cAMPS對(duì)面神經(jīng)后核內(nèi)側(cè)區(qū)吸氣神經(jīng)元/雙相呼氣神經(jīng)元放電活動(dòng)調(diào)控中的作用 3.2 Clonidine與Rp-cAMPS在A68930調(diào)控吸氣/雙相呼氣神經(jīng)元放電活動(dòng)中的作用 4、延髓面神經(jīng)后核內(nèi)側(cè)區(qū)神經(jīng)

14、細(xì)胞cAMP濃度的測定 采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)測定延髓面神經(jīng)后核內(nèi)側(cè)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞cAMP濃度的測定，將mNRF“島”在灌流槽中分別用MKS、5μmol/L A68930、2μmol/L SCH-23390灌流20分鐘后用酶聯(lián)免疫試劑盒測定cAMP濃度。結(jié)果顯示：激動(dòng)劑A68930組cAMP的濃度升高，與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.000）；拮抗劑SCH-23390組cAMP的濃度降低；與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.000）。

15、 5、多巴胺D1受體在延髓面神經(jīng)后核內(nèi)側(cè)區(qū)“島”的表達(dá) 采用熒光定量PCR測定檢測多巴胺D1受體在延髓面神經(jīng)后核內(nèi)側(cè)區(qū)“島”是否表達(dá)及表達(dá)的量。結(jié)果表明：mNRF“島”區(qū)多巴胺D1受體基因有表達(dá)；與對(duì)照組（大腦前額皮質(zhì)多巴胺D1受體基因的表達(dá)量）比較有統(tǒng)計(jì)出差異（t=24.226，P=0.000），延髓面神經(jīng)后核內(nèi)側(cè)區(qū)“島”多巴胺D1受體基因的表達(dá)量低于大腦前額皮質(zhì)的表達(dá)量，為大腦前額皮質(zhì)表達(dá)量的2-2.09倍。

16、 結(jié)論：①多巴胺D1受體對(duì)舌下神經(jīng)根呼吸節(jié)律性放電活動(dòng)有調(diào)節(jié)作用。②多巴胺D1調(diào)制mNRF區(qū)吸氣神經(jīng)元/雙相呼氣神經(jīng)元放電活動(dòng)；特異性受體激動(dòng)劑增強(qiáng)吸氣神經(jīng)元/雙相呼氣神經(jīng)元放電活動(dòng)，特異性受體抑制劑抑制吸氣神經(jīng)元/雙相呼氣神經(jīng)元放電活動(dòng)。③多巴胺D1受體影響mNRF區(qū)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)cAMP的水平。④pre-BotC“島”多巴胺D1受體有表達(dá)，相對(duì)于大腦前額皮層的表達(dá)較少。⑤forskolin與IBMX等cAMP激動(dòng)劑可以興奮吸氣神經(jīng)元/雙