丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS2的核酸適體對(duì)病毒生活周期的影響.pdf

1、世界上大約有3％(1.7億)的人感染了丙型肝炎病毒(HCV)，HCV可引起嚴(yán)重的肝臟疾病，如慢性肝炎、肝硬化乃至肝癌。由于缺少針對(duì)丙肝的疫苗，且目前的治療方法有一定的局限性，研究新型、高效的抗HCV藥物的重任迫在眉睫。NS2蛋白能夠影響子代病毒顆粒裝配，也能通過(guò)干擾宿主細(xì)胞的生理過(guò)程來(lái)促進(jìn)病毒的復(fù)制。以NS2蛋白作為藥物研究的靶點(diǎn)，具有巨大的潛力。核酸適體是一類新型的識(shí)別分子，具有親和力強(qiáng)、選擇性高、穩(wěn)定性好、易于修飾等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于生

2、物檢測(cè)和新藥開(kāi)發(fā)等方面。在HCV編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白中，針對(duì)NS2蛋白的藥物尚未見(jiàn)報(bào)道。本文以NS2蛋白為靶標(biāo)，篩選出特異結(jié)合的核酸適體，并研究了適體對(duì)病毒生活周期的影響，取得了以下結(jié)果：
　　(1)采用普通PCR方法成功擴(kuò)增出HCV NS2基因，并將目的基因成功構(gòu)建到pET28b原核表達(dá)載體中。
　　(2)將重組質(zhì)粒pET28b-NS2轉(zhuǎn)到BL21感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行蛋白大量表達(dá)，發(fā)現(xiàn)此蛋白可溶性低。采用超速離心法，并加入膜表面活

3、性劑一月桂酸，可獲得可溶性強(qiáng)的目的蛋白，用鎳柱進(jìn)一步純化得到蛋白。
　　(3)以純化的NS2蛋白為靶標(biāo)，經(jīng)過(guò)5輪篩選，得到特異結(jié)合的ssNDAaptamers。從中選擇三條適體(NS2-1、NS2-2、NS2-3)分析發(fā)現(xiàn)，這3種核酸適體能夠特異結(jié)合到NS2蛋白上，不會(huì)與對(duì)照蛋白HCV NS5B和LacZ發(fā)生非特異性結(jié)合。
　　(4)用熒光定量PCR和免疫熒光法檢測(cè)轉(zhuǎn)染核酸適體后細(xì)胞中的病毒復(fù)制和釋放能力變化，發(fā)現(xiàn)核酸適體以