家蠶細(xì)小病毒樣病毒(中國鎮(zhèn)江株)重組病毒的構(gòu)建及NS2蛋白的細(xì)胞定位.pdf

1、家蠶細(xì)小病毒樣病毒(Bombyx mori Parvo-like virus,BmDLV)原稱為家蠶濃核病毒Ⅱ型(Bombyx mori Densovirus typeⅡ,BmDNV-Ⅱ),是首例動物二分病毒,它是引起家蠶濃核癥的重要病原微生物之一。它與家蠶濃核病毒(BmDNV-Ⅰ)一樣,都感染家蠶的中腸組織圓筒形細(xì)胞,病毒粒子無囊膜,基因組都為單鏈線性的DNA并且都含末端重復(fù)序列。不同的是,該病毒的基因組分為兩個(gè)單鏈DNA分子(VD1

2、,6.6 kb；VD2,6.1 kb)且分別獨(dú)立包裝在不同的衣殼中；兩條鏈的末端重復(fù)序列中無回文序列；并且含有自身編碼的DNA聚合酶；該病毒的復(fù)制機(jī)制還未知。為了進(jìn)一步了解該病毒的特性,本研究構(gòu)建了家蠶細(xì)小病毒樣病毒中國鎮(zhèn)江株(BmPLV-Z)的基因組克隆及含報(bào)告基因eGFP的重組質(zhì)粒,并對克隆質(zhì)粒的感染性進(jìn)行了鑒定；另外,對病毒基因編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白NS2進(jìn)行了序列分析及細(xì)胞定位鑒定。
　　 本研究中,主要對BmPLN-Z進(jìn)行了

3、以下四方面的研究:(1)克隆病毒的基因組,構(gòu)建穩(wěn)定增殖的VD1和VD2基因組克隆質(zhì)粒,并繪制BmPLV-Z基因組的結(jié)構(gòu)圖；(2)檢測克隆質(zhì)粒在BmN細(xì)胞和家蠶幼蟲中的復(fù)制及其感染性；(3)構(gòu)建帶有報(bào)告基因eGFP的重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染BmN和Sf9細(xì)胞,并檢測重組質(zhì)粒的復(fù)制和病毒基因的表達(dá)；(4)分析病毒非結(jié)構(gòu)蛋白2(NS2)序列特征,并通過瞬時(shí)表達(dá)和免疫熒光檢測NS2在BmN細(xì)胞中的定位。
　　 1家蠶細(xì)小病毒樣病毒中國鎮(zhèn)江株基因組

4、克隆的構(gòu)建及基因組結(jié)構(gòu)圖的繪制
　　 根據(jù)病毒基因組末端序列特征,設(shè)計(jì)帶唯一酶切位點(diǎn)的引物,以裂解的病毒粒子作模板進(jìn)行基因組全長PCR擴(kuò)增。VD1全長克隆pT-VD1,經(jīng)全長引物一次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆獲得；VD2全長克隆pUC-VD2,則由基因組中的SacⅠ酶切位點(diǎn)分兩段擴(kuò)增、克隆,拼接重構(gòu)形成完整基因組全長克隆。對克隆質(zhì)粒的穩(wěn)定傳代和保存作了培養(yǎng)菌種和溫度的篩選,建立了穩(wěn)定繁殖和保存質(zhì)粒的方法；對克隆基因組進(jìn)行測序和結(jié)構(gòu)分析,

5、繪制了較完善的病毒基因組結(jié)構(gòu)圖。
　　 2基因組克隆的轉(zhuǎn)染及其感染性鑒定
　　 脂質(zhì)體包埋基因組克隆轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞和家蠶幼蟲,對克隆基因組的復(fù)制及感染性進(jìn)行檢測。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞無形態(tài)變化,家蠶幼蟲也正常生長；收集轉(zhuǎn)染后96 h的細(xì)胞和家蠶中腸組織,對其DNA和cDNA進(jìn)行PCR鑒定,結(jié)果未檢測到病毒基因組的復(fù)制。
　　 3重組質(zhì)粒pVD1-VPGFP和pVD1-AVPGFP的構(gòu)建
　　 將基因組克隆pT-VD

6、1用作載體,在vp基因后面插入報(bào)告基因eGFP和用eGFP替換vp基因進(jìn)行重組質(zhì)粒的構(gòu)建；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Sf9和BmN細(xì)胞進(jìn)行基因復(fù)制與表達(dá)檢測。通過上述實(shí)驗(yàn),成功地構(gòu)建了兩個(gè)含報(bào)告基因的重組質(zhì)粒pVD1-VPGFP和pVD1-ΔVPGFP,并間接地檢測了病毒基因組克隆在細(xì)胞中的復(fù)制和表達(dá)。
　　 4 BmPLV-Z-NS2的序列分析及細(xì)胞定位
　　 非結(jié)構(gòu)蛋白NS2是由VD1-ORF1編碼的。生物信息學(xué)分析表明BmPL

7、V-Z-NS2與細(xì)小病毒的NS2無同源性,而與染色體復(fù)制起始蛋白dnaA和DNA-binding反應(yīng)調(diào)節(jié)子有一定的同源性。NS2含有1個(gè)天冬酰胺-N-糖基化位點(diǎn)、3個(gè)酪蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)和3個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)等可能的功能位點(diǎn)。這些結(jié)構(gòu)特征顯示NS2可能是一個(gè)多功能蛋白?；蜣D(zhuǎn)錄分析表明NS2在病毒感染的初期表達(dá)量低而后期表達(dá)量升高。通過構(gòu)建的瞬時(shí)表達(dá)質(zhì)粒pFastBacHTb-ie1p-ns2,轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞,用anti-NS2多